保元湯對(duì)秀麗隱桿線蟲的抗衰老作用及機(jī)制研究

張訓(xùn)樂 王姍姍 趙佳惠 黃家情 聞 嫵 貢岳松

(南京中醫(yī)藥大學(xué)2016級(jí)碩士研究生，江蘇 南京 210046)

保元湯最早見于明·魏直的《博愛心鑒》，是治療元?dú)馓撊醯闹絼M方包含黃芪、人參、甘草、肉桂4味藥，全方可大補(bǔ)元?dú)?，尤補(bǔ)后天脾、肺之氣，健脾保肺溫腎，能治一切元?dú)馓撊踔Y，故名保元湯，并通過歷代醫(yī)家的臨床運(yùn)用，驗(yàn)證了其確切的臨床效果[1-2]。隨著現(xiàn)代研究的不斷深入，保元湯的臨床應(yīng)用也日益廣泛，相關(guān)研究表明保元湯在免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及抗氧化等方面有較好的作用[3-5]。我們基于這些研究推測(cè)，保元湯具有一定的抗衰老作用。線蟲是廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的模式生物，用于揭示先天免疫、氧化脅迫效應(yīng)、環(huán)境暴露與損傷的機(jī)制，其中秀麗隱桿線蟲具有生活周期短、易飼養(yǎng)、生物學(xué)終點(diǎn)多、在實(shí)驗(yàn)室可大量培養(yǎng)等特點(diǎn)，已成為衰老研究中常用的模式生物，并擁有與哺乳動(dòng)物同源的抗氧化脅迫機(jī)制和相關(guān)基因[6-7]。因此，我們嘗試?yán)眯沱愲[桿線蟲作為模型，觀察保元湯提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的延長作用，探討保元湯可能的抗衰老作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 蟲株與菌株 野生型N2秀麗隱桿線蟲，采用線蟲生長培養(yǎng)基(NGM)，以大腸桿菌Escherichia coli OP50 飼喂，由美國賓夕法尼亞大學(xué)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物 保元湯藥物組成：黃芪、人參、甘草、肉桂，比例6∶2∶2∶1(北京同仁堂南京藥店有限公司)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 NGM培養(yǎng)基配方：氯化鈉(NaCl)3 g，蛋白胨2.5 g，瓊脂17 g，磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀(K2HPO4-KH2PO4)緩沖液(1 mol/L，pH 6.0)25 mL，雙蒸水(ddH2O)975 mL，滅菌處理后加膽固醇溶液(5 mg/mL)1 mL，硫酸鎂溶液(MgSO4)(1 mol/L)1 mL，氯化鈣溶液(CaCl2)(1 mol/L)1 mL。S-培養(yǎng)基配方：K2HPO4-KH2PO4緩沖液(1 mol/L，pH 6.0)50 mL，NaCl 5.9 g，加水定容至1 L，滅菌處理后加膽固醇溶液(5 mg/mL)1 mL，混勻后量取977 mL混合液，加1M檸檬酸鉀緩沖液(pH 6.0)10 mL，痕量金屬溶液10 mL，MgSO4(1 mol/L)3 mL，CaCl2(1 mol/L)3 mL。線蟲M9緩沖液：KH2PO43 g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 6 g，NaCl 5 g，1 ml MgSO4，加 ddH2O至1 L，121℃滅菌。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司)；顯微鏡(日本Olympus公司)；高壓滅菌鍋[致微(廈門)儀器有限公司]；生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藥物提取 依據(jù)保元湯方藥物比例稱取藥材30 g，研成粉末，加10倍量水采用回流提取法提取1 h，提取3次，合并3次藥液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至100 mL，最后采用真空冷凍干燥法獲得保元湯粗提物。

1.4.2 線蟲培養(yǎng) 于空白的NGM培養(yǎng)基中央滴入50 μL左右的大腸桿菌菌液，用涂布器將菌液均勻涂布，注意菌液邊緣不宜太過，應(yīng)距離平板邊緣5 mm左右，采用團(tuán)塊法將秀麗隱桿線蟲接種在含大腸桿菌的NGM培養(yǎng)基上，20 °C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)[8]。

1.4.3 同步化處理 用液體NGM沖下培養(yǎng)基中的L4期秀麗隱桿線蟲成蟲，轉(zhuǎn)至10 mL無菌離心管中，高心機(jī)1300×g離心1 min,洗滌2次，保留與約0.25 mLNGM,加無菌水3.75 mL,加堿裂解液[氫氧化鈉(NaOH)(5 mol/L)0.5 mL，漂白劑(Bleach)1 mL]至混勻振蕩，每2 min至于顯微鏡下觀察秀麗隱桿線蟲線蟲裂解狀態(tài)，裂解時(shí)間不超過6 min。1300×g離心1 min，液體NGM洗滌2次，S-培養(yǎng)基洗滌2次，移除上清，加S-培養(yǎng)基8 mL，置于20 ℃培養(yǎng)箱中振搖孵育24 h，從而得到生長同期化的秀麗隱桿線蟲[9]。

1.4.4 實(shí)驗(yàn)分組 將同期化的秀麗隱桿線蟲分為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、保元湯組，空白組對(duì)照組不加任何藥物，溶劑對(duì)照組加二甲基亞礬溶劑，保元湯組分別加1000、500、200、100、50 μg/mL的保元湯提取物藥液培養(yǎng)，條件20 ℃恒溫，選用96孔板液體培養(yǎng)法進(jìn)行給藥干預(yù)培養(yǎng)。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 壽命實(shí)驗(yàn)[10-11]比較各組秀麗隱桿線蟲的壽命變化情況，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲由卵成長至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)，每組100條左右，給藥當(dāng)日年齡標(biāo)記為0。每日顯微鏡觀察秀麗隱桿線蟲的狀態(tài)，記錄存活、死亡數(shù)量，計(jì)算平均壽命。觀測(cè)前將96孔板置于搖床上輕輕振搖2 min，秀麗隱桿線蟲死亡判定標(biāo)準(zhǔn)為振動(dòng)或強(qiáng)光刺激秀麗隱桿線蟲不彎曲身體或頭部不擺動(dòng)，身體呈僵直狀態(tài)。

1.5.2 生殖力測(cè)定[12-13]比較各組秀麗隱桿線蟲的生殖力變化情況，采用同期化的L1期秀麗隱桿線蟲觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲由卵成長至L1期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。藥物干預(yù)48 h后，用移液器吸取秀麗隱桿線蟲，轉(zhuǎn)至標(biāo)注好的1.5 mL離心管中，1300×g離心1 min。移除上清，加線蟲M9緩沖液，1300×g離心1 min，重復(fù)2次。移液器吸取秀麗隱桿線蟲至空白NGM培養(yǎng)皿上，每板1條，每組15條，轉(zhuǎn)移至20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)每塊培養(yǎng)皿上的蟲卵數(shù)目。

1.5.3 運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定[14-15]比較各組秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動(dòng)能力變化情況，正常情況下其以S形向前移動(dòng)，衰老后運(yùn)動(dòng)能力下降，運(yùn)動(dòng)彎曲的頻率減少，可反映其生命活力，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲由卵成長至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。藥物干預(yù)6 d后，用移液器吸取線蟲，轉(zhuǎn)至標(biāo)注好的1.5 mL離心管中，1300×g離心1 min。移除上清，加線蟲M9緩沖液，1300×g離心1 min，重復(fù)2次。移液器吸取秀麗隱桿線蟲至空白NGM培養(yǎng)皿上，每板5條，每組15條，讓其自由運(yùn)動(dòng)1 min，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲1 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)S形的個(gè)數(shù)(即1 min內(nèi)走過的峰數(shù))，重復(fù)3次。

1.5.4 頭部擺動(dòng)測(cè)定[16-17]比較各組秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)變化情況，頭部擺動(dòng)行為定義為頭部擺動(dòng)方向改變且改變角度大于90°，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲由卵成長至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。藥物干預(yù)6 d后，用移液器吸取線蟲，轉(zhuǎn)至標(biāo)注好的1.5 mL離心管中，1300×g離心1 min。移除上清，加線蟲M9緩沖液，1300×g離心1 min，重復(fù)2次。移液器吸取秀麗隱桿線蟲至空白NGM培養(yǎng)皿上，每板5條，每組15條，讓其自由運(yùn)動(dòng)1 min后，觀察記錄其在1 min 內(nèi)頭部擺動(dòng)次數(shù)。

1.5.5 熱應(yīng)激[18-19]比較各組秀麗隱桿線蟲的熱應(yīng)激能力變化情況，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲由卵成長至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。藥物處理2 d后，每組15條，去除封口膜，將96孔板上秀麗隱桿線蟲一起轉(zhuǎn)移到35 ℃培養(yǎng)箱中熱應(yīng)激10 h，然后再將其轉(zhuǎn)移到20 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每日顯微鏡下觀察記錄秀麗隱桿線蟲死亡、存活條數(shù)，直至空白對(duì)照組秀麗隱桿線蟲存活率<10%。存活率(%)=(總數(shù)-死亡數(shù)目)/總數(shù)×100%。

1.5.6 氧化應(yīng)激[13,18]比較各組秀麗隱桿線蟲的氧化應(yīng)激能力變化情況，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲由卵成長至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。。藥物處理2 d后，每組15條，各組分別加入20 mmol/L百草枯，進(jìn)行氧化應(yīng)激處理，培養(yǎng)24 d后，開始每日顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲死亡、存活條數(shù)，直至空白對(duì)照組秀麗隱桿線蟲存活率<10%。

2 結(jié)果

2.1 各組秀麗隱桿線蟲壽命情況比較 見表1。

表1 各組秀麗隱桿線蟲壽命情況比較

由表1可見，溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲平均壽命與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。保元湯各組中100 、200、500 μg/mL組秀麗隱桿線蟲平均壽命較空白對(duì)照組均明顯延長，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但3組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；50、1000 μg/mL組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組秀麗隱桿線蟲生殖力情況比較 見表2。

表2 各組秀麗隱桿線蟲生殖力情況比較

由表2可見，溶劑對(duì)照組及保元湯各組秀麗隱桿線蟲平均產(chǎn)卵量與空白對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，保元湯各組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)能力情況比較 見表3。

表3 各組秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)能力情況比較

由表3可見，溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲1 min平均運(yùn)動(dòng)峰數(shù)與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。保元湯各組中200、500、1000 μg/mL組秀麗隱桿線蟲1 min平均運(yùn)動(dòng)峰數(shù)較空白對(duì)照組均明顯增多，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但3組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；50、100 μg/mL組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組秀麗隱桿線蟲頭部擺動(dòng)情況比較 見表4。

表4 各組秀麗隱桿線蟲頭部擺動(dòng)情況比較 次，

由表4可見，溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲1 min平均擺動(dòng)次數(shù)與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。保元湯各組中200、500、1000 μg/mL組秀麗隱桿線蟲1 min平均擺動(dòng)次數(shù)較空白對(duì)照組均明顯增多，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但3組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；50、100 μg/mL組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 各組秀麗隱桿線蟲熱應(yīng)激測(cè)試比較 熱應(yīng)激測(cè)試后的第1、2天空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲均出現(xiàn)明顯死亡，而保元湯各組可以顯著提高秀麗隱桿線蟲的耐熱能力，其中200、500、1000 μg/mL組存活率均明顯高于空白對(duì)照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。熱應(yīng)激測(cè)試第3天空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲幾乎全部死亡，而保元湯各組還有約10%以上存活率，其中200、500、1000 μg/mL組存活率明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組秀麗隱桿線蟲熱應(yīng)激測(cè)試比較(*P<0.05)

2.6 各組秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激測(cè)試比較 氧化應(yīng)激測(cè)試第1、2、3天空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲均出現(xiàn)明顯死亡，而保元湯各組可以顯著提高秀麗隱桿線蟲的抗氧化應(yīng)激損傷的能力，其中200、500、1000 μg/mL組存活率均明顯高于空白對(duì)照組。氧化應(yīng)激測(cè)試第4天空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組秀麗隱桿線蟲幾乎全部死亡，而保元湯各組還有約10%以上的存活率，其中200、500、1000 μg/mL組存活率明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激測(cè)試比較(*P<0.05)

3 討論

中醫(yī)學(xué)對(duì)衰老的認(rèn)識(shí)和研究源遠(yuǎn)流長，早在《內(nèi)經(jīng)》中就有“”正氣存內(nèi)，邪不可干”的論述，認(rèn)為氣是構(gòu)成人體和維持人體生命活動(dòng)的基本物質(zhì)，機(jī)體正氣充足，則抵御外邪能力強(qiáng)，從而身強(qiáng)體健不易發(fā)病而可得“天年”，氣虛、氣不足可導(dǎo)致機(jī)體的臟腑功能減退，加速衰老[20-21]。中醫(yī)學(xué)歷經(jīng)幾千年的臨床實(shí)踐，在如何延年益壽和抗衰老方面積累了豐富的用藥經(jīng)驗(yàn)，其中保元湯作為補(bǔ)氣劑的代表方，經(jīng)歷代醫(yī)家的臨床運(yùn)用驗(yàn)證，療效確切，可益氣補(bǔ)虛培元，主治虛損勞怯、元?dú)獠蛔?、倦怠乏力等[22-23]。方中人參性稟中和，益元?dú)舛蒲a(bǔ)脾肺之氣；黃芪則側(cè)重補(bǔ)益衛(wèi)表之氣，固腠理而補(bǔ)元?dú)?，與人參相須為用，增強(qiáng)補(bǔ)氣之功；肉桂鼓舞命門真氣，鼓動(dòng)氣血運(yùn)行，可助心陽和溫化水飲；甘草益氣和中，調(diào)和諸藥。四藥合用，補(bǔ)元?dú)猓?，陰陽兼顧，徹里徹外，通補(bǔ)無瀉，而奏氣足、精充、神旺的功效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，保元湯在免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及抗氧化作用等方面均有較好的藥理作用[24-25]。

衰老是指生物體在正常狀況下發(fā)育成熟后，隨著年齡的繼續(xù)增加，機(jī)體的生理功能出現(xiàn)逐漸下降的表現(xiàn)，最終導(dǎo)致生命體死亡的過程，因此在延緩衰老的研究中壽命的長短可作為其一個(gè)定量指標(biāo)[26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，保元湯在100 、200、500 μg/mL劑量時(shí)可明顯延長秀麗隱桿線蟲的壽命，表明保元湯對(duì)秀麗隱桿線蟲而言有延緩衰老的作用。

在衰老領(lǐng)域，長壽和生殖總是被聯(lián)系在一起，且普遍認(rèn)為壽命與其生殖能力成反比關(guān)系，對(duì)大多數(shù)生物體而言，當(dāng)生殖期結(jié)束則機(jī)體就逐漸開始呈現(xiàn)衰老。有研究認(rèn)為，包括線蟲、黑腹果蠅、人類等有機(jī)體都有通過干預(yù)生殖功能來實(shí)現(xiàn)延長壽命的可能性，但目前這個(gè)觀點(diǎn)還有頗多爭議[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，保元湯在延緩秀麗隱桿線蟲衰老的同時(shí)并沒有影響其產(chǎn)卵量，說明保元湯對(duì)秀麗隱桿線蟲并沒有生殖毒性，也不是通過抑制生殖來延長壽命。

運(yùn)動(dòng)能力可反映秀麗隱桿線蟲的生命活力，秀麗隱桿線蟲在運(yùn)動(dòng)過程中以正弦曲線S的形式向前移動(dòng)，當(dāng)秀麗隱桿線蟲出現(xiàn)衰老時(shí)其運(yùn)動(dòng)能力也會(huì)明顯下降，因此我們通過觀察秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)來輔助證明藥物延緩衰老的作用。同時(shí)秀麗隱桿線蟲頭部擺動(dòng)能力在一定程度上反映秀麗隱桿線蟲的衰老，其頭部擺動(dòng)與身體肌壁組織、攝食行為有一定的關(guān)系，擺動(dòng)次數(shù)越多說明，說明其生命活力越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，保元湯在200、500、1000 μg/mL劑量時(shí)能提高秀麗隱桿線蟲的活動(dòng)能力，增加頭部擺動(dòng)次數(shù)，這些可能是抑制了衰老過程中神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉的退化，延長秀麗隱桿線蟲壽命的同時(shí)提高生命活力。

有研究表明，壓力應(yīng)激抵抗能力的提高與生物體壽命延長有關(guān)[18]，幾乎所有已知的長壽突變體線蟲在熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激、重金屬毒性、紫外線放射的壓力下，都顯示出了更強(qiáng)的抵抗外界環(huán)境壓力的能力。因此，壓力應(yīng)激實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可作為檢測(cè)藥物延壽作用的常規(guī)指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組用百草枯制作氧化應(yīng)激損傷，而保元湯在200、500、1000 μg/mL劑量時(shí)可明顯提高秀麗隱桿線蟲抗氧化應(yīng)激能力，提高存活率。除了氧化應(yīng)激外，熱應(yīng)激也是衰老研究中常用的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)之一，在相關(guān)線蟲長壽突變株的研究中發(fā)現(xiàn)，提高熱激轉(zhuǎn)錄因子1(HSF-1)表達(dá)，也能延長線蟲的壽命和提高應(yīng)激抗性[28-29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在熱應(yīng)激條件下，保元湯在200、500、1000 μg/mL劑量時(shí)表現(xiàn)出了明顯的抗熱應(yīng)激能力。這一結(jié)果預(yù)示保元湯抗線蟲衰老的作用可能與提高HSF-1有關(guān)，其相互關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，保元湯能夠有效延長秀麗隱桿線蟲的平均壽命，而不影響其生殖功能，具有延緩衰老的作用，其機(jī)制可能與提高秀麗隱桿線蟲抗應(yīng)激能力有關(guān)。然而有關(guān)保元湯更多的抗衰老作用機(jī)制有待將來進(jìn)一步研究。