不同殺菌劑對隴南花椒根腐病病原菌的室內(nèi)毒力測定

田鳳鳴，陳 強(qiáng)，何九軍，卓平清，王讓軍

(1.隴南師范高等專科學(xué)校 農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 隴南 742500;2.隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 隴南 742500)

花椒產(chǎn)業(yè)已成為隴南市6個宜椒縣(區(qū))、80個鄉(xiāng)(鎮(zhèn))、92 萬農(nóng)民的主要經(jīng)濟(jì)來源，重點(diǎn)突出的“一區(qū)五片”，即武都區(qū)、宕昌縣沙灣片、文縣臨江片、康縣平洛片、西和縣大橋片、禮縣下四區(qū)片花椒生產(chǎn)基地，基本實(shí)現(xiàn)了栽培區(qū)的全覆蓋[1].花椒在生長發(fā)育過程中，由于環(huán)境不適或受病原菌的侵害，經(jīng)常會出現(xiàn)一些影響花椒樹的生長、掛果結(jié)實(shí)和產(chǎn)品質(zhì)量的病害.常見病害有花椒菟絲子、花椒銹病、花椒根腐病、花椒落葉病、花椒炭疽病、花椒潰瘍病、花椒枯梢病、花椒枯枝病、花椒葉斑病、花椒膏藥病等[2].其中由腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani(Mart)Sacc.)[3]引起的花椒根腐病導(dǎo)致根系腐爛，地上部分葉片變小枝條發(fā)育不全，最終導(dǎo)致整株枯死，嚴(yán)重影響花椒產(chǎn)量和品質(zhì)，給花椒產(chǎn)業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失.花椒根腐病的防治一直是生產(chǎn)上難以解決的問題.由于花椒病蟲害多發(fā)，農(nóng)藥和化肥的使用量大，且有關(guān)部門對花椒生產(chǎn)、加工、流通的監(jiān)管力度不夠，致使花椒生產(chǎn)存在較大的生態(tài)和食品安全隱患.目前防治花椒根腐病的藥物主要有周玲燕[4]提出的甲基布托津、多菌靈、粉銹寧藥物，韓生錄等[5]提出的甲基硫菌靈藥物，其藥物單一，長期使用，田間效果會降低.

本實(shí)驗(yàn)選用14種低毒的農(nóng)藥為殺菌劑，以本實(shí)驗(yàn)室分離出的花椒根腐病病原菌茄腐鐮孢菌H1為目標(biāo)菌， 采用菌絲生長法對茄腐鐮孢菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，以期篩選出高效、污染小、低毒的農(nóng)藥藥品，為后期田間有效防治花椒根腐病提供可靠的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

病原菌由本實(shí)驗(yàn)室從隴南武都區(qū)花椒種植基地采樣，從典型的花椒根腐病病株中分離獲得，經(jīng)致病性實(shí)驗(yàn)及分子鑒定確定茄腐鐮孢菌(Fusariumsolani)是造成隴南花椒根腐病的主要病原菌，命名為H1，該病原菌保存于4℃冰箱，藥物試驗(yàn)時在PDA培養(yǎng)基中活化備用.

1.2 供試藥劑

14種殺菌劑的詳細(xì)情況見表1.

1.3 方法

1.3.1 PDA培養(yǎng)基的制備

馬鈴薯200 g(去皮，切小塊，沸水中20 min～30 min，四層紗布過濾，濾液備用)，瓊脂粉15 g～20 g，葡萄糖20 g加入馬鈴薯濾液中，少量水溶解后定容至1000 mL，高壓滅菌后倒平板.

1.3.2 菌餅的制備

將4℃保存的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d～5 d，用無菌瓊脂打孔器打成6 mm的菌餅備用.

1.3.3 含藥培養(yǎng)基的制備

對供試農(nóng)藥，根據(jù)藥劑活性，每種農(nóng)藥設(shè)置5個不同的系列質(zhì)量濃度，將配好的PDA培養(yǎng)基滅菌后，待溫度到50 ℃～60 ℃時，用移液槍取9 mL的PDA培養(yǎng)基和1 mL配制好的農(nóng)藥加入無菌離心管中，搖勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中，每種梯度的農(nóng)藥重復(fù)3次，對照組中加9 mL的PDA培養(yǎng)基和1mL的無菌水倒入平板備用.

1.3.4 室內(nèi)毒力測定試驗(yàn)-菌絲生長速率法

在無菌操作條件下，將培養(yǎng)好的菌餅利用接種器接種于含藥平板中央，菌絲面朝下，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，封上封口膜，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，72 h后根據(jù)空白對照培養(yǎng)皿中的菌絲的生長情況，利用十字交叉法測定菌落直徑，取其平均值，菌落直徑用mm統(tǒng)計.

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

將統(tǒng)計好的菌落直徑的數(shù)據(jù)用以下公式計算每種梯度的農(nóng)藥抑制率，并將其換算成對應(yīng)概率值作為縱坐標(biāo)y， 以濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)x， 使用 DPS 7.05 軟件計算每種農(nóng)藥的毒力回歸方程y= ax+b，并分析EC50值和最終不同殺菌劑對花椒根腐病病原菌的相對抑制效果．

菌落增長直徑D(mm)=測量菌落平均值-6.

(1)

菌絲生長抑制率(%)=(處理菌落增長直徑(D1)/對照菌落增長直徑(D2)×100%.

(2)

2 結(jié)果與分析

本試驗(yàn)選取14種殺菌劑分析不同殺菌劑對花椒根腐病主要病原菌茄腐鐮孢菌H1菌絲的抑制作用.該14種殺菌劑均為低毒性殺菌劑，其中選取了三種來自不同廠家的枯草芽孢桿菌來分別測定對花椒根腐病病原菌茄腐鐮孢菌的室內(nèi)毒力抑制效果(見表2).

表1 供藥試劑及生產(chǎn)廠家

表2 14種不同殺菌劑的處理濃度及抑制率

殺菌劑質(zhì)量濃度(mg/L)抑制率(%)殺菌劑質(zhì)量濃度(mg/L)抑制率(%)代森錳鋅600052.8400047.5200041.6100035.750030.3氟硅唑458.4249.4140.40.531.90.2524.3甲基硫菌靈10082.95042.22520.712.59.26.250.8多菌靈455.7247.1138.40.530.40.2523.3枯草芽孢桿菌(300億/克)472.9269.3162.40.556.50.2547.2枯草芽孢桿菌(10億芽孢/克)600061.1400055.8200046.4100037.250028.4枯草芽孢桿菌(1000億/克)10062.15056.62551.112.545.66.2540.2氯溴異氰尿酸100005000100010010

表3 不同殺菌劑對花椒根腐病病原菌室內(nèi)毒力測定結(jié)果

由表1、表2表明，選取的14種殺菌劑除氯溴異氰尿酸殺菌劑對該菌無抑制活性外，其余13種均有不同程度的抑制活性，并且此13種殺菌劑的回歸方程相關(guān)系數(shù)均大于0.90，與1較接近，說明兩變量線性關(guān)系密切，試驗(yàn)可信度高.按照不同藥劑的活性，在5種不同質(zhì)量濃度處理下，隨質(zhì)量濃度的增加抑制率也隨之增大(見表2)，其中300億/克的枯草芽孢桿菌、氟硅唑、四霉素、多菌靈、咯菌腈5種殺菌劑在處理濃度為4 mg/L時，抑制率分別達(dá)到72.9%、58.4%、61.8%、55.7%、59.9%，對茄腐鐮孢菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制效果，EC50值分別為0.41 mg/L、2.08 mg/L、2.39 mg/L、2.57 mg/L、3.02 mg/L，其中對該菌毒力最強(qiáng)的殺菌劑為300億/克的枯草芽孢桿菌，此結(jié)果與室內(nèi)5種較強(qiáng)殺菌劑對病原菌菌絲生長的影響結(jié)果相一致，隨殺菌劑濃度的增加，病原菌菌絲的生長也逐漸減慢，300億/克的枯草芽孢桿菌在4 mg/L時病原菌菌絲生長最慢(見圖1)；其次1 000億個/克的枯草芽孢桿菌、甲基硫菌靈、寡雄腐霉菌對該菌也表現(xiàn)出了相對較強(qiáng)的毒力活性，其處理濃度為100 mg/L時，抑制率分別達(dá)到62.1%、82.9%、51.3%，其EC50值分別21.37 mg/L、54.95 mg/L、89.13 mg/L；噁霉靈、笨醚甲環(huán)唑、根腐靈對該菌的毒力相對較弱，其處理濃度分別500 mg/L時、抑制率分別達(dá)到61.8%、52.6%、59.5%，其EC50值分別223.87 mg/L、254.47 mg/L、346.76 mg/L；10億芽孢/克的枯草芽孢桿菌、代森錳鋅對該菌的毒力表現(xiàn)出明顯較弱的毒力活性，其處理濃度分別6 000 mg/L時，抑制率分別61.1%、52.8%，其EC50值分別為2 570 mg/L和5 248.07 mg/L；氯溴異氰尿酸在5種處理濃度下對該菌的毒力強(qiáng)度為0，對菌絲無抑制效果.因此通過室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示，14種殺菌劑對腐皮鐮孢菌的抑制效果排名為300億/克的枯草芽孢桿菌>氟硅唑>四霉素>多菌靈>咯菌腈>1 000億個/克的枯草芽孢桿菌>甲基硫菌靈>寡雄腐霉菌>噁霉靈>笨醚甲環(huán)唑>根腐靈>10億芽孢/克的枯草芽孢桿菌>代森錳鋅>氯溴異氰尿酸.

圖1 5種較強(qiáng)殺菌劑對病原菌菌絲生長的影響

CK為對照菌絲生長結(jié)果.A1-A5分別為300億/克的枯草芽孢桿菌的不同處理濃度4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L.B1-B5分別為氟硅唑的不同處理濃度4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L；C1-C5分別為四霉素的不同處理濃度4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L；D1-D5分別為多菌靈的不同處理濃度4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L；E1-E5分別為咯菌腈的不同處理濃度4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L.

3 結(jié)論

長期以來，化學(xué)農(nóng)藥在植物病害的防治中起主要的作用[6].根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)報道，長期單一不合理的使用不僅給植物生產(chǎn)中的食品帶來農(nóng)藥殘留而且病原菌對藥物容易產(chǎn)生抗性等問題[7-9]，為減少花椒生產(chǎn)中存在的生態(tài)和食品安全隱患，篩選出高效、低殘留、低毒的替代殺菌劑[10]是花椒生產(chǎn)中和根腐病病害防治中急需解決的問題之一.

本試驗(yàn)從14種殺菌劑中篩選出5種對茄腐鐮孢菌抑制較強(qiáng)的殺菌劑，分別為300億/克的枯草芽孢桿菌、氟硅唑、四霉素、多菌靈、咯菌腈，在處理濃度僅為4 mg/L時就能表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制效果，此5種殺菌劑可作為防治花椒根腐病的主要推廣藥物.在田間防治中可進(jìn)行交替使用，減緩病原菌對單一藥物的抗性.但是從5種殺菌劑的類型來看，300億/克的枯草芽孢桿菌作為生物殺菌劑，其抑制效果強(qiáng)于其他4種化學(xué)殺菌劑，在處理濃度為4mg/L時，抑制率可達(dá)72.9%，EC50值為0.41 mg/L，在低處理濃度為0.25 mg/L時，抑制率依然可達(dá)47.2%.特別是枯草桿菌有著很快的繁殖速度，且有廣泛的抗菌性和較強(qiáng)的抗逆性，是多種植物病原菌的拮抗菌，因此生物殺菌劑的開發(fā)和利用越來越受到科學(xué)家的青睞.以上結(jié)果與滕朕等人研究的生物農(nóng)藥對人參立枯病菌的室內(nèi)毒力測定結(jié)果相同[11].

室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示在相同處理濃度下，枯草芽孢桿菌的抑制效果強(qiáng)于同等濃度處理的其他化學(xué)殺菌劑.其處理濃度為100 mg/L時，1000億個/克的枯草芽孢桿菌抑制效果強(qiáng)于甲基硫菌靈，處理濃度為6000 mg/L時，10億芽孢/克的枯草芽孢桿菌抑制效果強(qiáng)于代森錳鋅，這與枯草芽孢桿菌殺菌劑的殺菌效果優(yōu)于某些化學(xué)農(nóng)藥的研究結(jié)果是一致的[12-14].購買于三種公司的枯草芽孢桿菌在不同的處理濃度下其表現(xiàn)出的抑制活性是不相同的，300億/克的枯草芽孢桿菌(山東京青農(nóng)業(yè)科技有限公司)>1000億個/克的枯草芽孢桿菌(中國農(nóng)科院植保所廊坊農(nóng)藥中試廠)>10億芽孢/克的枯草芽孢桿菌(撒爾夫,河南農(nóng)化有限公司).另外，本試驗(yàn)結(jié)果僅測定了單一殺菌劑對花椒根腐病主要病原菌茄腐鐮孢菌的室內(nèi)毒力作用，在后續(xù)的研究工作中，還需將此結(jié)果與田間藥效試驗(yàn)相結(jié)合，并同時開展新的殺菌劑復(fù)配來防治花椒根腐病的相關(guān)試驗(yàn)， 新藥劑的開發(fā)對于生產(chǎn)具有十分重要的意義[15].在高毒農(nóng)藥的禁用下，最經(jīng)濟(jì)有效的防治措施就是選育抗病品種[16]，這為花椒根腐病病害的抗病資源的鑒定和篩選工作具有重要意義.