透射電子顯微鏡觀察肝細(xì)胞性肝癌中溶酶體相關(guān)細(xì)胞器變化的特征

章 梟，劉炯炯，蘇義林，許宜琪，耿夢雅，裴文俊，高家林

(1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 安徽省立醫(yī)院 a.兒外科；b.國際醫(yī)療部，安徽 合肥 230001；2.皖南醫(yī)學(xué)院 a.研究生學(xué)院；b.中心實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002；3.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 內(nèi)分泌科，安徽 蕪湖 241001)

溶酶體是存在于所有真核細(xì)胞的酸性細(xì)胞器，最初被認(rèn)為是一種負(fù)責(zé)降解的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器[1-3]，溶酶體含有不同的水解酶，能夠消化由內(nèi)吞、吞噬和自噬遞送的大分子，進(jìn)行降解和再循環(huán)利用[2]。二十世紀(jì)中葉，溶酶體被認(rèn)為是在細(xì)胞死亡信號傳導(dǎo)中起著重要作用的“自殺袋”，溶酶體涉及3種主要的細(xì)胞死亡途徑：細(xì)胞凋亡、壞死和自噬[1]。溶酶體是正確清除成熟自噬體的最關(guān)鍵成分，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，發(fā)生最終的降解[1]。近期越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體在蛋白質(zhì)分泌、能量代謝、細(xì)胞信號等過程中起著關(guān)鍵作用[2]，甚至在癌癥生物學(xué)中也扮演著重要的角色[1]。

溶酶體異常導(dǎo)致癌癥，在一些情況下，溶酶體的改變常促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[2]，溶酶體的破壞也會引起相關(guān)疾病，如神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病、胰腺炎、溶酶體貯積癥和惡性腫瘤[1-3]。在細(xì)胞轉(zhuǎn)化和癌癥進(jìn)展期間，溶酶體會改變其定位、體積和組成，通過其釋放的酶、溶酶體亞群數(shù)量的增加[4]，調(diào)節(jié)和促進(jìn)癌細(xì)胞的黏附、增殖和侵襲[2]。溶酶體膜上的糖基化蛋白家族——溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosome-associated membrane proteins,LAMPs)能影響癌癥進(jìn)展的各種過程，如LAMP1和LAMP2一起參與局部腫瘤進(jìn)展、細(xì)胞外基質(zhì)的黏附和重塑、遷移、耐藥和轉(zhuǎn)移等致癌過程[1]。營養(yǎng)缺乏條件下，腫瘤細(xì)胞通過自噬溶酶體降解途徑維持其增殖和轉(zhuǎn)移能力[5]。自噬-溶酶體途徑與腫瘤的一些特征密切相關(guān)，如逃避細(xì)胞死亡途徑、逃避免疫監(jiān)視、調(diào)節(jié)代謝紊亂等[2]。肝癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，溶酶體相關(guān)細(xì)胞器在肝細(xì)胞性肝癌中有無改變，目前尚無報道，本研究將采用透射電鏡方法，從超微形態(tài)學(xué)角度探討兩者之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 肝癌腫瘤標(biāo)本收集自中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院和弋磯山醫(yī)院的肝癌患者術(shù)后標(biāo)本，共3例，男性2例，女性1例，年齡(65.0±4.5)歲。其中電鏡按照癌灶中心、癌旁、毗鄰癌旁的肝組織(距離癌腫邊緣2～3 cm)分類取材，光鏡(HE染色、免疫組化)標(biāo)本只取癌灶中心送檢。作為正常對照的肝臟組織來自非腫瘤的肝內(nèi)膽管結(jié)石手術(shù)病人的術(shù)后標(biāo)本，共3例，男性2例，女性1例，年齡(67.6±9.3)歲，從術(shù)后病理的標(biāo)本中少量分離取得。本研究實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)所在醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 HE染色 組織取材約1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，投入10%中性福爾馬林固定液固定，常溫保存。將固定充分后的組織脫水透明、浸蠟包埋、切片貼片、脫蠟至水后，切片入Harris蘇木精染色3～8 min，并經(jīng)1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗及0.6%氨水返藍(lán)，再經(jīng)流水沖洗及伊紅染液中染色1～3 min，脫水封片后，顯微鏡觀察和圖像采集。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 石蠟標(biāo)本4 μm厚切片，脫蠟和水化后，磷酸鹽酸緩沖液(PBS pH=7.4)沖洗3次，每次3 min；高溫高壓修復(fù)抗原：EDTA抗原修復(fù)液與蒸餾水以1∶50的比例配置2 000 mL修復(fù)液，置于高壓鍋修復(fù)，關(guān)閉火源，冷卻至室溫，冷水沖洗10 min，3% H2O2室溫孵育10 min；PBS沖洗3次，每次3 min，切片分別加入一抗稀釋液稀釋的一抗(AFP、Ki67、P53均購自中杉金橋公司)，4℃孵育過夜；PBS沖洗3次，每次3 min，每張切片加HRP標(biāo)記的二抗(中杉金橋)，室溫下孵育30 min；PBS沖洗，滴加DAB顯色液顯色5 min，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.5%鹽酸酒精分化，經(jīng)梯度乙醇脫水烤干，中性樹膠封片。

1.4 透射電鏡 制備肝臟組織電子顯微鏡樣本，將癌灶、癌旁、毗鄰癌旁的正常肝組織及非肝癌患者肝臟組織的樣本組織直徑修切為1 mm3大小，固定在2.5%戊二醛中1 h，然后使用1%的四氧化鋨進(jìn)行處理，脫水并包埋在Durcupan(Sigma-Aldrich)中，將樣品切成60 nm薄片，安裝在Cu格柵上，并與乙酸鈾酰和檸檬酸鉛對比，通過電子顯微鏡(JEM-1200EX，日本JEOL公司)觀察樣品形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5 溶酶體(自噬溶酶體)計數(shù) 切片隨機(jī)從左上到右下依次在電鏡下選取6個視野(5 000×)，并由3位專業(yè)人員對2 μm2的電鏡圖片進(jìn)行總?cè)苊阁w(含自噬溶酶體)和自噬溶酶體計數(shù)，取平均值后統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 肝癌標(biāo)本的光鏡下組織病理學(xué)觀察 對癌灶標(biāo)本進(jìn)行HE染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞呈多角形或圓形，排列成條索狀或巢狀，核大且核仁明顯，比較豐富的血管分布在癌巢和癌索之間，間質(zhì)成分較少見。AFP免疫標(biāo)記陽性，提示為肝細(xì)胞性肝癌。在癌組織中可以看到癌細(xì)胞漿內(nèi)明顯的棕色著色顆粒，與核染區(qū)形成較明顯的對比，提示P53和Ki67高表達(dá)(圖1)。

圖1 光鏡下肝癌標(biāo)本組織病理學(xué)特點(diǎn)

2.2 肝癌標(biāo)本的電鏡下超微結(jié)構(gòu)的一般特征 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，所有標(biāo)本鏡下都表現(xiàn)出良好的可觀測性，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等主要亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，胞核、胞質(zhì)染色良好、著色均一，提示固定、切片及標(biāo)本的制備完全符合標(biāo)準(zhǔn)(圖2)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，相較于正常肝組織、癌旁和毗鄰癌旁肝組織標(biāo)本，在癌灶中心的標(biāo)本胞核明顯增大，且普遍存在雙核或多核現(xiàn)象(圖2A)，提示腫瘤細(xì)胞的核異型性明顯。癌灶中心的肝癌細(xì)胞表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)密集排列的大小不一的線粒體(圖2A，紅色箭頭)，提示腫瘤及癌灶中心的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的代謝特征。此外，在癌灶中心的細(xì)胞很難見到明顯的細(xì)胞間界線，而在癌旁、毗鄰癌旁及正常肝臟樣本中，細(xì)胞間的邊界則非常清楚(圖2B～D，虛線處)。在腫瘤患者癌旁及毗鄰癌旁的肝組織切片中可以看到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹(圖2B、C，藍(lán)色箭頭)。在癌灶中心及癌旁樣本中較少見到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多見，癌旁樣本雖可見到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但普遍表現(xiàn)出腫脹和脫顆粒(核糖體)存在(圖2B，星號處)，而在正常肝臟樣本中正常的帶有核糖體顆粒的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可以普遍看到(圖2D，星號處)。

2.3 溶酶體亞細(xì)胞器在肝癌樣本中的變化特征 電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同組織標(biāo)本溶酶體形態(tài)學(xué)上未見明顯異常，見圖3A。定量分析結(jié)果顯示，癌灶中心、癌旁的肝組織總?cè)苊阁w計數(shù)均高于正常肝組織(P<0.05)，而毗鄰癌旁的肝組織與正常肝組織差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；癌灶中心、癌旁、毗鄰癌旁的肝組織自噬溶酶體計數(shù)均高于正常肝組織(P<0.05)，見圖3B、C。

A～D依次為癌灶中心、癌旁、毗鄰癌旁的肝組織、正常非腫瘤患者肝臟組織，5 000×。M.線粒體，L.溶酶體，LD.脂肪滴，N.核。

A.電鏡下溶酶體數(shù)量形態(tài)觀察；B.溶酶體數(shù)量統(tǒng)計(F=23.200,P<0.001);C.自噬溶酶體數(shù)量統(tǒng)計(F=38.000,P<0.001)。

3 討論

肝癌(主要指肝細(xì)胞癌)是全球第二大致死性癌癥，病死率持續(xù)上升[6]。肝癌是一種非傳染性疾病[7]，其危險因素構(gòu)成多樣，如慢性乙型和丙型肝炎病毒感染[8]、吸煙、飲酒、非酒精性脂肪肝、肥胖和糖尿病[9]。深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制并探討其潛在的干預(yù)靶點(diǎn)具有極其重要的臨床意義。溶酶體與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。有研究指出，溶酶體所介導(dǎo)的自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的平衡作用[10-12]。然而，溶酶體相關(guān)細(xì)胞器在肝細(xì)胞性肝癌中有無改變，其在肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)生過程中有何作用，尚無報道。

本研究采用透射電鏡從超微結(jié)構(gòu)出發(fā)，觀察溶酶體形態(tài)和數(shù)量在肝癌組織中的變化情況及一般特征，并通過其與腫瘤部位相關(guān)性的密切度，從癌灶、癌旁、毗鄰癌旁的肝組織及非肝癌患者肝臟標(biāo)本四個層次來觀察溶酶體的變化情況。結(jié)果顯示，溶酶體的形態(tài)沒有發(fā)生明顯的異常變化，其數(shù)量在癌旁和癌灶樣本中明顯增多。對于溶酶體數(shù)目的增多，我們推測有以下兩種可能：①溶酶體信號通路的過渡激活所致；②溶酶體在腫瘤組織中功能不足所致的代償性增多。這些功能不足的溶酶體不能執(zhí)行其完整的清道夫功能而導(dǎo)致微環(huán)境的改變，并促成有利于腫瘤發(fā)生的環(huán)境。因此，后續(xù)對腫瘤環(huán)境中溶酶體功能的檢測可能會提供答案。當(dāng)然，這種靜態(tài)的功能檢測即使有問題，也不足以反映溶酶體與腫瘤之間的確切關(guān)聯(lián)：即到底是溶酶體功能障礙導(dǎo)致腫瘤，還是已經(jīng)形成的腫瘤導(dǎo)致了溶酶體功能的異常？所以，為進(jìn)一步弄清上述問題，還需要進(jìn)行兩個試驗(yàn)。第一，肝癌建模驗(yàn)證試驗(yàn)，即通過建立動物肝癌模型，動態(tài)觀察和監(jiān)測肝癌形成過程中溶酶體功能的變化；第二，建立溶酶體功能障礙模型，比如氯喹阻斷溶酶體酸化功能，利用裸鼠成瘤試驗(yàn)觀察其是否有利于肝癌的發(fā)生、發(fā)展。這些將會是課題后續(xù)的重點(diǎn)研究內(nèi)容。

自噬溶酶體同樣是在形態(tài)上反映部分溶酶體功能的重要指標(biāo)[12]。自噬溶酶體的形成至少可以證明溶酶體的貨物吞噬功能是正常的[12]。但在本研究中，自噬溶酶體的數(shù)量在癌灶、癌旁及毗鄰癌旁的肝組織均升高，且越近癌灶中心越明顯。由于自噬的特殊性，自噬溶酶體增多這一現(xiàn)象可以得出完全不同的兩個結(jié)論：第一，自噬通路受損，自噬溶酶體降解障礙，導(dǎo)致堆積增多；第二，自噬本身的上調(diào)導(dǎo)致自噬溶酶體形成增多。這就好比是高速公路上，我們看到大量增多的汽車，既有可能是前方道路堵塞導(dǎo)致車流行走緩慢所致，也有可能是正好碰到節(jié)假日，上高速的車輛增多所致。因此，后續(xù)我們將進(jìn)一步進(jìn)行自噬流檢測，并確認(rèn)真實(shí)的自噬通路狀態(tài)[13]。如在離體細(xì)胞水平的紅綠熒光雙標(biāo)試驗(yàn)[14]、氯喹阻滯的P62翻轉(zhuǎn)試驗(yàn)。但是在體水平的檢測就要困難很多，目前有成功報道的并不多，且很難得到準(zhǔn)確的結(jié)論。綜上，盡管我們尚不能明確溶酶體以及自噬溶酶體在肝癌組織中的增多與肝癌發(fā)生的具體相關(guān)性機(jī)制，但僅就溶酶體和自噬溶酶體數(shù)量在肝癌患者組織中增多這一發(fā)現(xiàn)，已然翻開了溶酶體與肝癌發(fā)病相關(guān)機(jī)制研究的新篇章。后續(xù)，我們將進(jìn)一步深入研究其機(jī)制。