熒光染色鏡檢法與KOH濕片鏡檢法在皮膚淺部真菌感染診斷中的應(yīng)用

趙 野，姜日花，朱明姬,蓋保東，王 珂

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.皮膚科;2.胃腸結(jié)直腸肛門(mén)外科;3.產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春130033)

淺部真菌病是一種皮膚科常見(jiàn)病，近年來(lái)，隨著腫瘤、艾滋病等免疫功能受損患者的增多，以及抗菌類藥物濫用，真菌感染發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。侵襲性真菌感染(IFD)是感染性疾病死亡的主要原因之一[1-2]。目前臨床診斷中真菌感染最常用檢查辦法是真菌鏡檢及真菌培養(yǎng)，KOH濕片法是門(mén)診真菌鏡檢常用的方法，真菌培養(yǎng)法也是公認(rèn)的診斷真菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但這兩種檢查方法均易被標(biāo)本、檢查技師水平等因素干擾，導(dǎo)致兩者的假陽(yáng)性及假陰性增加，兩種檢查方法準(zhǔn)確率甚至可低至15%[3]。

近年來(lái)出現(xiàn)了熒光染色法檢查真菌感染疾病，在肺曲菌病的既往研究中體現(xiàn)了熒光染色法的快捷、敏感、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。其機(jī)理是由于熒光染色劑特異性結(jié)合真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)，標(biāo)記真菌菌體，在熒光顯微鏡下可以觀察到真菌菌絲和孢子呈亮藍(lán)色或亮綠色的熒光，結(jié)構(gòu)清晰，可輕易與背景和雜質(zhì)相鑒別。現(xiàn)將吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院門(mén)診疑診淺部真菌感染的患者作為研究對(duì)象，以期探討在淺部真菌感染診斷中熒光染色法的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2020年1月-2020年6月期間吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院皮膚科門(mén)診就診患者中疑診為淺部真菌感染的450例患者，其中手足癬198例、體股癬167例、甲癬54例、頭癬31例;在病損部位采集皮屑、甲屑、斷發(fā)、發(fā)根等作為檢驗(yàn)標(biāo)本。選取的所有患者均未接受抗真菌治療。

1.2 試劑與儀器

試劑與儀器：熒光染色液(江蘇萊芙時(shí)代生物有限公司)；10% KOH溶液(自行配置)；奧林巴斯BX41熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.3 方法

1.3.1取材 所有皮損部位均先應(yīng)用75%乙醇消毒，然后應(yīng)用一次性手術(shù)刀刮取疑診部位的皮屑、甲屑、斷發(fā)標(biāo)本，將取材標(biāo)本均分為兩等份，分別進(jìn)行熒光染色體以及KOH濕片鏡檢。以上操作均由2名醫(yī)師完成，結(jié)果一致記錄為檢驗(yàn)合格。

1.3.2KOH濕片鏡檢法 取適量取材樣本置于載玻片上，加1滴10%KOH溶液，覆蓋蓋玻片。將載玻片在酒精燈火焰上快速通過(guò)2-3次進(jìn)行加熱，避免溶液沸騰造成結(jié)晶形成，之后輕壓蓋玻片，擠壓標(biāo)本，排出氣泡，在顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。

1.3.3熒光染色法 載玻片上取適量樣本后加入1滴熒光染色液，覆蓋并輕壓蓋玻片，排出氣泡，在顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本組研究采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，其中，計(jì)數(shù)資料以例(率)形式表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏡下表現(xiàn)

KOH濕片法在顯微鏡下背景雜亂，真菌菌絲及孢子與背景差異較小，無(wú)明顯顏色區(qū)別，不易辨別；熒光染色法鏡下觀察背景及雜質(zhì)呈暗黑色，而真菌孢子及菌絲呈亮藍(lán)色，真菌輪廓清晰與周圍環(huán)境差異明顯，容易辨別。

2.2 疑診淺部真菌感染應(yīng)用兩種鏡檢法的陽(yáng)性率比較

熒光染色法與KOH濕片法陽(yáng)性率比較兩種方法的總陽(yáng)性率分別為276例(61.33%)、193例(42.89%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.67，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩種方法在各種淺部真菌病鏡檢結(jié)果比較

3 討論

淺部真菌病是一種常見(jiàn)的感染性皮膚病，多因真菌侵犯人體體表組織如皮膚、指(趾)甲、毛發(fā)等所致，根據(jù)發(fā)病部位不同可分為體股癬、手足癬、甲癬、頭癬等各類癬病，皮膚癬菌、馬拉色菌、念珠菌等是引發(fā)該病常見(jiàn)的真菌[6]。

KOH濕片法是目前國(guó)內(nèi)最常用的真菌鏡檢方法，也是真菌感染性皮膚病與其他疾病鑒別的重要手段之一，也是因其操作簡(jiǎn)便，成本低廉，已在臨床檢驗(yàn)中普遍應(yīng)用[7-8]。但KOH濕片鏡檢法也有不足之處：背景環(huán)境雜亂，標(biāo)本未經(jīng)染色，真菌與樣本顏色一致，因?yàn)榧?xì)胞壁、纖維及小氣泡、脂滴的存在導(dǎo)致難以凸顯真菌菌絲及孢子結(jié)構(gòu)，如患者既往不規(guī)律涂抹藥物、樣本中菌絲或孢子量較低時(shí)，極易造成漏檢，往往需要經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)技師，才能提高直接鏡檢的準(zhǔn)確率。

熒光染色法采用酶聯(lián)染色法，染色液主要成分包括高純度的熒光素和特定比例的KOH溶液，熒光素標(biāo)記的幾丁質(zhì)酶能快速識(shí)別并特異性的結(jié)合真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，形成強(qiáng)熒光復(fù)合物，在紫外光作用下，使真菌結(jié)構(gòu)呈亮藍(lán)色熒光，熒光染色劑并不標(biāo)記脂滴，故脂滴與孢子容易分辨。真菌標(biāo)本中的纖維素也可被熒光染色法標(biāo)記，在熒光顯微鏡下也可發(fā)出亮藍(lán)色熒光，但纖維素并沒(méi)有真菌典型的菌絲橫隔和出芽現(xiàn)象，可明確辨別，減少了假陽(yáng)性結(jié)果[9-12]。鏡下菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚易辨，清晰，反差大，孢子 染 色 后 結(jié) 構(gòu) 清 晰，易 于 分辨，大大提高真菌檢出陽(yáng)性率，且顯著縮短真菌鏡檢時(shí)間。熒光染色法容易掌握，滴加染液后無(wú)需加熱，角質(zhì)溶解快于KOH濕片法，鏡下背景干凈，真菌形態(tài)清晰顯著，易于觀察，降低了疑難標(biāo)本(如菌絲量少、角質(zhì)過(guò)厚、僅有孢子、或外涂藥膏)直接鏡檢的假陽(yáng)性率，提高準(zhǔn)確率，其缺點(diǎn)主要在于試劑成本略高。

本研究將門(mén)診收集的450例疑診淺部真菌感染患者的標(biāo)本分別進(jìn)行熒光染色法和KOH濕片法精簡(jiǎn)檢查，通過(guò)比較兩者的檢出陽(yáng)性率，結(jié)果表明熒光染色法的檢出陽(yáng)性率(61.33%)明顯高于KOH濕片法(42.89%)；且不同來(lái)源的標(biāo)本(皮屑、甲屑、毛發(fā))采用熒光染色法檢出陽(yáng)性率也高于KOH濕片法。

綜上所述，熒光染色法和KOH濕片法兩種方法對(duì)于皮膚淺表真菌感染的診斷均有積極意義，具有操作簡(jiǎn)單的特性；但熒光染色法的檢出陽(yáng)性率更高，為臨床疑診真菌感染患者提供更加快捷、準(zhǔn)確的檢查方法，在直接鏡檢的臨床應(yīng)用中具有更好的推廣價(jià)值。