赤芍治療肝纖維化網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制探討

安禎祥,張安邦,何遠(yuǎn)利,黃 丹,王 敏,唐東昕,王 芳

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,貴州 貴陽(yáng)550001)

肝纖維化(Hepatic fibrosis,HF)是指肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)的彌漫性過(guò)度沉積與異常分布,是肝臟的病理性修復(fù)反應(yīng),是慢性肝病向肝硬化/肝癌發(fā)展的關(guān)鍵步驟和重要環(huán)節(jié)。肝纖維化在組織學(xué)上是可逆的,而肝硬化難以逆轉(zhuǎn)[1]。有效地預(yù)防、逆轉(zhuǎn)肝纖維化可以延緩或防止肝硬化發(fā)生。目前尚無(wú)治療纖維化的化學(xué)或生物藥物,而中醫(yī)藥在該領(lǐng)域有明確的優(yōu)勢(shì)[2]?？估w維化治療是一個(gè)綜合治療,其中病因治療和抗炎治療是首要策略,但是針對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)沉積和降解,抑制肝星狀細(xì)胞活化仍然是不能替代的治療。赤芍是活血涼血、散瘀止痛的代表藥物,廣泛用于急慢性肝病治療中。但是作為單一用藥,需進(jìn)一步深入研究。赤芍(Paeoniae RadixRubra)為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactifloraPall.)或川赤芍(Paeonia veitchiiLynch)的干燥根,味苦,微寒,入肝經(jīng),具有涼血散瘀、清熱止痛的功效,可用于肝郁脅痛、癥瘕腹痛等肝膽疾病[3-5]。研究表明赤芍具有一定的保肝、抗肝纖維化作用[6-9]。然而其抗HF藥效物質(zhì)及作用機(jī)制需要進(jìn)一步明確。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是多學(xué)科的交叉產(chǎn)物,利用系統(tǒng)生物學(xué)、系統(tǒng)藥理學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等,突破了傳統(tǒng)“單藥物、單靶點(diǎn)、單途徑”,切合中藥的“整體性、多靶點(diǎn)、多通道”特點(diǎn),通過(guò)構(gòu)建藥物與基因、靶點(diǎn)和疾病之間的相互作用網(wǎng)絡(luò),探尋中藥的作用機(jī)制。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)赤芍抗HF的活性成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路進(jìn)行分析,探討其治療肝纖維化的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 赤芍活性成分與作用靶標(biāo)的篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)篩選赤芍所有化學(xué)成分,以口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%和類(lèi)藥性指數(shù)(Drug like index,DL)≥0.18為篩選指標(biāo),活性成分輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索其作用靶標(biāo),運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)査詢靶標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的基因名稱(chēng)。

1.2 肝纖維化疾病靶標(biāo)收集

以“hepatic fibrosis”為關(guān)鍵詞,檢索GeneCards(https://www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM(https://www.omim.org)數(shù)據(jù)庫(kù)中肝纖維化相關(guān)基因,并去除重復(fù)基因。

1.3 赤芍活性成分靶點(diǎn)與肝纖維化靶點(diǎn)蛋白相互作用

將赤芍有效活性成分作用靶點(diǎn)與肝纖維化靶點(diǎn)取交集,得到兩者的韋恩圖。

1.4 成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在GeneCards(http://www.genecards.org/)、OMIM(http://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索肝纖維化疾病相關(guān)靶蛋白,物種設(shè)置為人類(lèi),利用Uniprot(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)將其轉(zhuǎn)化為基因名稱(chēng),采用R語(yǔ)言提取成分作用靶點(diǎn)與肝纖維化疾病靶點(diǎn)的共有靶點(diǎn),Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建赤芍活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與可視化

String(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫(kù)收集了大量的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系(Protein-protein interactions,PPI)。將赤芍活性成分靶標(biāo)與肝纖維化疾病靶標(biāo)的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù),物種限定為“Homo sapiens(人)”,構(gòu)建赤芍成分靶標(biāo)-肝纖維化疾病靶標(biāo)PPI。采用R語(yǔ)言篩選出PPI中的前30個(gè)核心蛋白。使用Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析和可視化處理,得到赤芍治療肝纖維化的蛋白相互作用的PPI柱狀圖和點(diǎn)狀圖。

1.5 基因功能及通路富集分析

Gene ontology(http://www.geneontology.org)廣泛用于基因功能的注釋。Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes(KEGG,https://www.kegg.jp)是一個(gè)整合化學(xué)、基因組和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫(kù),用于從分子水平信息中了解生物系統(tǒng)的高級(jí)功能和用途。將赤芍治療HF關(guān)鍵靶標(biāo)用R語(yǔ)言及Bioconductor進(jìn)行基因功能和通路富集分析,通過(guò)條形圖及氣泡圖展示。

2 結(jié)果

2.1 赤芍活性成分與靶點(diǎn)篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到赤芍化合物119個(gè),其中OB≥30%,DL≥0.18的活性成分29個(gè),獲取赤芍化學(xué)成分及作用靶標(biāo)信息,包括芍藥苷、芍藥苷元酮、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、兒茶素、并沒(méi)食子酸、(2R,3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、β-谷甾醇、黃芩素、campest-5-en-3beta-ol、stigmast-7-en-3-ol等化合物。見(jiàn)表1。根據(jù)赤芍活性成分預(yù)測(cè)其作用靶標(biāo),12個(gè)活性成分共作用于74個(gè)靶標(biāo),去除重復(fù)靶標(biāo),獲得41個(gè)靶標(biāo),可見(jiàn)一個(gè)成分作用多個(gè)靶點(diǎn),亦可見(jiàn)多個(gè)活性成分作用同一靶標(biāo)。運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)査詢靶標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的基因簡(jiǎn)稱(chēng)。見(jiàn)表2。

表1 赤芍的活性成分

表2 赤芍的藥物靶點(diǎn)

2.2 肝纖維化疾病靶標(biāo)收集結(jié)果

GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)收集HF疾病靶標(biāo)4 033個(gè)。肝纖維化主要通過(guò)CF跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)器、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Beta 1、腫瘤壞死因子、干擾素γ、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、IL6等靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)。圖3為部分靶點(diǎn)。

續(xù)表2

續(xù)表2

表3 肝纖維化部分靶點(diǎn)

續(xù)表3

2.3 赤芍成分靶點(diǎn)-肝纖維化靶點(diǎn)交集

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得到赤芍治療疾病的靶標(biāo)41個(gè),GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)搜索HF疾病的靶點(diǎn)4 033個(gè),使用R語(yǔ)言對(duì)赤芍作用靶點(diǎn)與肝纖維化的疾病靶點(diǎn)取交集,構(gòu)建赤芍活性成分靶點(diǎn)-肝纖維化靶點(diǎn)韋恩圖,獲得赤芍與HF共同作用靶標(biāo)33個(gè)。見(jiàn)圖1。

2.4 赤芍抗肝纖維化主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建赤芍抗肝纖維化成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖2。其中一個(gè)疾病節(jié)點(diǎn),1個(gè)藥物節(jié)點(diǎn),12個(gè)藥物活性成分節(jié)點(diǎn),33個(gè)肝纖維化相關(guān)基因節(jié)點(diǎn),赤芍的12種活性成分協(xié)同作用于33個(gè)肝纖維化基因,三角形、橢圓形節(jié)點(diǎn)分別代表赤芍活性成分、疾病的靶蛋白,邊代表藥物、活性成分和疾病靶蛋白的相互作用,體現(xiàn)了赤芍抗肝纖維化多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。結(jié)果表明,赤芍29種活性成分中,與HF作用靶點(diǎn)直接相連的有12種活性成分,為赤芍治療HF的有效活性成分,分別為芍藥苷、芍藥苷元酮、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、兒茶酚、并沒(méi)食子酸、(2R,3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、β-谷甾醇、黃芩素、campest-5-en-3beta-ol、stigmast-7-en-3-ol?？梢?jiàn)多個(gè)成分同時(shí)作用于一個(gè)或幾個(gè)相同的靶點(diǎn),部分靶點(diǎn)有多個(gè)作用成分,因此這些的靶點(diǎn)和成分成為赤芍中主要的活性成分和靶點(diǎn)。

圖2 赤芍-肝纖維化-成分-基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 赤芍靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING軟件,將韋恩圖中33個(gè)靶點(diǎn)作出蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖及柱狀圖,結(jié)果IL6、VEGFA、ESR1、FOS、CASP3、RELA、AR、CYCS、CASP8、PGR、CASP9、HIF1A、CCNB1等基因處于核心地位,分別有20、19、18、18、17、17、15、14、12、12、11、11、10節(jié)點(diǎn)。見(jiàn)圖3、圖4所示。

圖3 赤芍與HF共有PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 赤芍抗HF作用靶點(diǎn)PPI分析

2.6 赤芍治療肝纖維化基因功能富集分析

為進(jìn)一步了解赤芍治療肝纖維化關(guān)鍵靶標(biāo)在生物體中發(fā)揮的作用,運(yùn)行R語(yǔ)言對(duì)33個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行GO基因功能富集分析,共獲得73個(gè)生物學(xué)功能,根據(jù)P-vaule大小進(jìn)行排序,選取前20條目展示,見(jiàn)圖5。柱狀圖中縱坐標(biāo)表示P值,橫坐標(biāo)表示富集的數(shù)目。P值越小顏色越深。結(jié)果顯示,赤芍治療肝纖維化關(guān)鍵靶標(biāo)主要富集在對(duì)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA聚合酶II特異性、核受體的活動(dòng)、類(lèi)固醇激素受體活性、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體活性、近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動(dòng)功能活動(dòng)中。

圖5 赤芍抗肝纖維化作用靶點(diǎn)的GO分析

2.7 赤芍治療肝纖維化通路富集分析

運(yùn)行R語(yǔ)言對(duì)33個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行KEGG通路富集分析,符合篩選條件的信號(hào)通路有78條,顯示P值最小的前20條通路繪制氣泡圖,見(jiàn)圖6。氣泡圖中縱坐標(biāo)表示通路的名稱(chēng),橫坐標(biāo)表示通路所占比例。P值越小顏色越深。其中與肝纖維化相關(guān)程度密切的信號(hào)通路有細(xì)胞凋亡、Th17細(xì)胞分化、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、p53信號(hào)通路。赤芍抗HF部分通路圖(乙肝、IL-17信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡)。見(jiàn)圖7-圖9。

圖6 赤芍抗肝纖維化作用靶點(diǎn)的KEGG分析氣泡圖

圖7 赤芍對(duì)乙型肝炎作用靶點(diǎn)的作用位置

圖9 赤芍對(duì)細(xì)胞凋亡作用靶點(diǎn)的作用位置

3 討論

肝纖維化屬于中醫(yī)“脅痛”“積聚”范疇,基本病機(jī)為正虛瘀積,肝絡(luò)受損,與肝絡(luò)病密切相關(guān)。肝絡(luò)是指肝臟的小血管,能營(yíng)養(yǎng)肝臟及調(diào)節(jié)肝臟功能。肝纖維化病理關(guān)鍵為假小葉,假小葉病理基礎(chǔ)在肝血竇。肝絡(luò)與肝血竇的結(jié)構(gòu)與生理相似,具有密不可分的關(guān)系,因此從“絡(luò)病”治療肝纖維化是一個(gè)重要的方法[10]。赤芍具有活血化瘀功效,是絡(luò)病治療的較好選擇。

圖8 赤芍對(duì)IL-17信號(hào)通路作用靶點(diǎn)的作用位置

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù),按口服生物利用度(OB)≥30%且類(lèi)藥性(DL)≥0.18的條件篩選赤芍活性化學(xué)成分29個(gè),包括芍藥苷、芍藥苷元酮、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、兒茶素、并沒(méi)食子酸、(2R,3R)-4-甲氧基-二苯乙烯、β-谷甾醇、黃 芩 素、campest-5-en-3beta-ol、stigmast-7-en-3-ol等 化合物,其中主要的化學(xué)成分是單萜苷類(lèi)、酚類(lèi)、多糖等化合物,單萜苷類(lèi)含有芍藥苷、芍藥新苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷元酮、芍藥甙元酮、苯甲酰芍藥苷、苯甲酰羥基芍藥苷[11]。研究表明,赤芍中芍藥苷、兒茶素以及β-谷甾醇的量較高[12],這些化學(xué)成分為其功效的基礎(chǔ)。芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷對(duì)四氯化碳所致小鼠急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用[13]。芍藥苷對(duì)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化起保護(hù)作用[14];芍藥苷也可通過(guò)TGF-β1/Smads信號(hào)通路對(duì)放射引起的大鼠肝纖維化起保護(hù)作用[8,15]。β-谷甾醇對(duì)小鼠肝纖維化有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與TGFβ/Smad2/3和TNF-α-NF-κB信號(hào)通路相關(guān)[16]?？上抡{(diào)Ⅰ型膠原纖維和α-SMA的基因和蛋白表達(dá)[17]。

從赤芍治療肝纖維化的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)中,赤芍治療肝纖維化的效應(yīng)機(jī)制可能與IL6、VEGFA、ESR1、FOS、CASP3、RELA、AR、CYCS、CASP8、PGR、CASP9、HIF1A、CCNB1等靶標(biāo)基因相關(guān)。肝竇毛細(xì)血管化則肝細(xì)胞物質(zhì)交換出現(xiàn)障礙。肝纖維化伴隨肝竇毛細(xì)血管化,肝臟新生血管與肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[18]。組織缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)促進(jìn)VEGF表達(dá)和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng),促進(jìn)新血管生成,HIF-1α/VEGF信號(hào)通路是肝纖維化的重要調(diào)節(jié)通路[19]。IL-6與肝細(xì)胞炎癥壞死嚴(yán)重度及纖維化程度關(guān)系密切[20]。炎癥機(jī)制是各種病因所致慢性肝病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)共同過(guò)程,是肝纖維化進(jìn)展的核心機(jī)制,從這一機(jī)制著手進(jìn)行肝纖維化診治具有重要價(jià)值[21]。NF-κB可通過(guò)調(diào)控多種抗炎因子的表達(dá)來(lái)影響肝纖維化的進(jìn)展,NF-κB抑制劑也已在臨床上得到應(yīng)用。NF-κB對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)及肝纖維化的形成具有重要調(diào)節(jié)作用[22]。肝纖維化與NF-κB信號(hào)通路的多種炎癥介質(zhì)有關(guān)[23],NF-κB信號(hào)通路通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞、HSC等細(xì)胞的調(diào)節(jié),影響肝纖維化的發(fā)展[24]。RELA是NF-κB通路中的主要活性成分,可影響肝纖維化的形成[25]。GO基因功能分析表明赤芍治療肝纖維化關(guān)鍵靶標(biāo)主要富集在DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制,細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡功能活動(dòng)中。KEGG通路富集分析,與肝纖維化密切相關(guān)的有細(xì)胞凋亡、Th17細(xì)胞分化、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、p53信號(hào)通路。研究表明,赤芍水提物影響bcl-2、bax、caspase-3三種蛋白表達(dá),促進(jìn)活化的HSC凋亡,減少酒精性肝纖維化的發(fā)生[26]。可見(jiàn)赤芍干預(yù)治療肝纖維化具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探析赤芍治療肝纖維化的分子機(jī)制,赤芍12個(gè)活性成分共作用于41個(gè)靶標(biāo),可見(jiàn)一個(gè)成分作用多個(gè)靶點(diǎn),亦可見(jiàn)多個(gè)活性成分作用同一靶標(biāo),可影響細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、核受體活性、DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制等生命活動(dòng),可通過(guò)細(xì)胞凋亡、Th17細(xì)胞分化、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、p53信號(hào)通路干預(yù)治療肝纖維化,多種活性成分通過(guò)多靶標(biāo)、多途徑、多通路、協(xié)同作用治療HF,為赤芍治療肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供了參考。