王不留行藥材中多糖含量測定研究

羅素菜,張海江

(1.浙江省中藥研究所有限公司,浙江 杭州310053;2.淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,江蘇 淮安223003)

王不留行又名麥藍(lán)菜,為石竹科植物麥藍(lán)菜(Vaccaria segetalis(Neck.)Garcker)的干燥成熟種子,其植物資源豐富,除華南外,都有分布。王不留行為傳統(tǒng)常用藥,具有通乳、通淋、通經(jīng)等功效,其化學(xué)成分主要有三萜皂苷、黃酮苷、環(huán)肽、類脂和脂肪酸、多糖等[1-2]。近年來我們通過對王不留行的化學(xué)成分及其生物活性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)王不留行中的活性多糖為葡聚糖,由水溶性多糖和難溶性多糖組成,其中難溶性多糖所占比重較大,2種多糖均有顯著的利尿通淋作用,在醫(yī)用方面有很大的開發(fā)價(jià)值。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)及資料[3-7]可知,現(xiàn)階段測定的多糖大多是水溶性多糖,主要采用紫外分光光度法測定,操作繁瑣,重復(fù)性差,因此本研究運(yùn)用HPLC-ELSD法對組成多糖的單糖進(jìn)行定量分析,以期為其質(zhì)量控制提供標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司);6000型蒸發(fā)光散色檢測器(美國奧泰公司);ME-204E型電子分析天平(瑞士梅特勒公司);DHG電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 藥物及試劑

王不留行藥材分別采自河南、河北、甘肅、四川、云南、江蘇,經(jīng)浙江省中藥研究所有限公司藥材室鑒定為石竹科植物麥藍(lán)菜Vaccaria segetalis(Neck.)Garcker的干燥成熟種子);葡萄糖對照品(中國藥品檢定研究院,批號110833-201205);乙醇(分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司);乙腈(色譜純,TEDIA);三氟乙酸(分析純,麥克林);水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Prevail carbohydrate ES糖柱(250 mm×4.6 mm,5μm,Alltech);流動(dòng)相:乙腈-水(75∶25);流速:1.0m L/min。理論塔板數(shù)按葡萄糖峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2 供試品溶液制備

取本品粉末(過三號篩不過五號篩)約0.1 g,置圓底燒瓶中,加50 m L蒸餾水,加熱回流2 h,趁熱過濾(200目篩網(wǎng)),用20 m L熱水分次洗滌濾渣及濾器,合并濾液及洗滌液,置圓底燒瓶中,加數(shù)滴消泡劑,旋轉(zhuǎn)濃縮至近干,加約10m L蒸餾水,搖勻,緩慢加入無水乙醇,調(diào)至乙醇濃度為80%左右,醇沉過夜,離心,棄去上清液,沉淀用乙醇多次洗滌后,氮?dú)獯蹈?用15 m L的1.0 mol·L-1三氟乙酸轉(zhuǎn)移至20 m L頂空進(jìn)樣瓶中,充入氮?dú)?封口,搖勻,置110℃烘箱水解2 h,取出,放冷,轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中,水解液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(60～65℃)至近干,加乙醇重復(fù)上述步驟,直至三氟乙酸除盡,殘?jiān)诱麴s水溶解并定容至50 m L量瓶中,搖勻,即得。

2.3 單因素考察

2.3.1 不同過濾目數(shù)考察 分別考察了100目和200目篩網(wǎng)過濾時(shí)對多糖含量的影響,結(jié)果表明200目篩網(wǎng)過濾的多糖含量高于100目的,原因可能是100目篩網(wǎng)過濾時(shí)有少量種皮過濾下去,導(dǎo)致水解不完全引起,故最終選擇200目篩網(wǎng)過濾。見表1。

表1 不同過濾目數(shù)考察

2.3.2 不同乙醇濃度對醇沉的影響 操作步驟同“2.2”,乙醇濃度分別調(diào)為75%、80%、85%,結(jié)果表明乙醇濃度在75%~85%之間對多糖含量測定無顯著性差異(RSD<3%),查閱2015版《中國藥典》及相關(guān)資料,大多選用80%乙醇進(jìn)行醇沉,故最終醇沉濃度選擇80%乙醇。見表2。

表2 乙醇濃度比較 (%)

2.3.3 消泡劑的影響 由于多糖提取液中含有大量難溶性多糖,溶液呈糊狀,在旋轉(zhuǎn)濃縮過程中會出現(xiàn)很多泡沫,易造成提取液反沖現(xiàn)象,故需加入消泡劑。結(jié)果表明,消泡劑對多糖的測定結(jié)果無明顯影響(RSD<3%),通過空白試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了消泡劑對多糖含量測定無干擾。見表3。

表3 消泡劑的影響

2.3.4 提取時(shí)間比較 操作步驟同“2.2”,提取時(shí)間分別設(shè)為2、4、6h,結(jié)果表明,提取時(shí)間為2h時(shí),提取已完全。提取時(shí)間為6 h時(shí),多糖含量反而有所下降,故最終選擇提取時(shí)間為2 h,數(shù)據(jù)見表4。

表4 提取時(shí)間比較

2.3.5 水解條件優(yōu)化 分別考察酸濃度(0.5 mol·L-1、1.0mol·L-1、2.0 mol·L-1),水解溫度(100℃、110℃、120℃),水解時(shí)間(1 h、2 h、3 h),以多糖含量為指標(biāo),確定最優(yōu)條件,見圖1。結(jié)果表明最優(yōu)水解條件為酸濃度1.0 mol·L-1,水解溫度110℃,水解時(shí)間2 h。

圖1 水解條件優(yōu)化結(jié)果

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件,精密吸取對照品溶液10μL,供試品溶液、空白溶劑各5μL,注入液相色譜儀,得到相應(yīng)的色譜圖。空白溶劑色譜中,在與對照品及供試品色譜相對應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn),證明王不留行中的其他成分對多糖測定無干擾,該測定方法專屬性好。測定結(jié)果見圖2、圖3、圖4。

圖2 葡萄糖對照品高效液相色譜

圖3 空白對照樣品高效液相色譜

圖4 王不留行藥材高效液相色譜

2.4.2 線性關(guān)系 分別稱取葡萄糖對照品適量,加水制成含葡萄糖1.809 2mg/mL的對照品溶液,作為對照品溶液A。精密移取對照品溶液A 3.5 mL置10 mL量瓶中,加水至刻度,作為對照品溶液B(0.633 2mg/mL)。精密移取對照品溶液A 1.0 mL置5m L量瓶中,加水至刻度,作為對照品溶液C(0.126 7mg/mL)。精密吸取對照品溶液A 15、10μL,對照品溶液B 5、10、15、20μL,以及對照品溶液C 10μL,注入HPLC儀,記錄色譜圖和峰面積。以對照品進(jìn)樣量的對數(shù)為橫坐標(biāo)(X),葡萄糖色譜峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到葡萄糖的回歸方程為Y=0.579 8X-4.049 9,R2=0.994 6。結(jié)果表明,葡萄糖在1.267~27.140μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下的對照品溶液B 10μL,注入HPLC儀測定,共進(jìn)樣6次,記錄色譜圖和峰面積。結(jié)果顯示,峰面積RSD為0.96%,表明精密度較好。見表6。

表6 精密度試驗(yàn)

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液分別于配制后0 h、4 h、8h、12h、16h、20h、24h進(jìn)樣,按“2.3.1”項(xiàng)下線性方程計(jì)算多糖含量RSD為1.0%,表明樣品溶液中多糖的含量在配制后24h內(nèi)穩(wěn)定性較好,因此樣品溶液在配制后24 h內(nèi)測定即可。結(jié)果見表7。

表7 穩(wěn)定性試驗(yàn) (%)

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份王不留行藥材粉末,按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密吸取溶液5μL,注入HPLC儀測定,記錄色譜圖和峰面積。結(jié)果顯示,王不留行藥材中多糖含量為56.2%(RSD=1.3%,n=6),表明該方法重復(fù)性較好。結(jié)果見表8。

表8 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 (%)

2.4.6 加樣回收率 取6份王不留行藥材粉末0.05g,置100 m L圓底燒瓶中,向每只燒瓶中加入葡萄糖對照品溶液1.0 m L(23.79 mg·m L-1),按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取溶液5μL,注入HPLC儀。記錄色譜圖和峰面積,計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示加樣回收率為95.3%~102.1%,RSD為2.7%,表明該方法回收率較好。結(jié)果見表9。

表9 加樣回收率測定結(jié)果

2.5 多糖含量測定

取6批不同產(chǎn)地的王不留行藥材(河南、河北、甘肅、四川、云南、江蘇)粉末0.1g,每批2份,按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密吸取溶液5μL,注入HPLC儀。記錄色譜圖和峰面積,計(jì)算各供試品中多糖的含量。結(jié)果測得上述6個(gè)批號樣品中多糖的含量分別為57.1%、58.3%、63.7%、37.0%、49.4%、8.6%(n=2)。

3 討論

3.1 樣品前處理方法

《中華人民共和國藥典》2015版[8]對多糖提取先采用80%乙醇除雜,再回流提取,作者在測定王不留行藥材多糖含量時(shí),也對藥典方法進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)水提醇沉法優(yōu)于藥典方法(52.2% VS 38.5%)。另外,作者還比較了蒸發(fā)皿加熱濃縮和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,發(fā)現(xiàn)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮優(yōu)于蒸發(fā)皿加熱濃縮(52.2% VS 31.9%)。因此本研究采用水提醇沉-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮作為樣品前處理方法。

3.2 色譜條件考察

本研究考察了不同比例的流動(dòng)相(乙腈∶水=75∶25、70∶30、80∶20)和不 同品牌 的色譜 柱(Hypersil氨基柱,Welch氨基柱,Alltech糖柱)對多糖含量測定的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用氨基柱時(shí),色譜圖的基線噪音大,保留時(shí)間漂移,柱流失大,使用壽命短;而Alltech糖柱基線噪音小,柱效好,保留時(shí)間穩(wěn)定,使用壽命長,故選擇Alltech糖柱,見圖5、圖6、圖7。另外,本項(xiàng)目前期研究確定王不留行多糖為均一性多糖,其一級結(jié)構(gòu)為葡聚糖,多糖水解成單糖后,只有葡萄糖一個(gè)成分,不同比例的流動(dòng)相對分離效果影響不大。結(jié)合保留時(shí)間及峰形情況,最終選擇乙腈∶水=75∶25作為流動(dòng)相。

圖5 依利特NH2柱

圖6 月旭NH2柱

圖7 奧泰Prevail Carbohydrate ES柱

3.3 其他

近些年,隨著色譜技術(shù)的不斷發(fā)展,色譜法已成為分離、分析多糖的主流方法,其相較于比色法測定更具準(zhǔn)確性。不過將多糖裂解成單糖是色譜法分析的前提,降解所得到的單糖通常不能直接進(jìn)行HPLC分析,用UV檢測器時(shí)需將樣品衍生化再進(jìn)行檢測,操作繁瑣。但根據(jù)單糖具有強(qiáng)極性及無紫外和熒光吸收特征,RID和ELSD檢測器則可用非衍生化法。RID能分離不同單糖并測定其含量,但檢測器的靈敏度較低,受溫度影響較大;而HPLC-ELSD法能測定糖的種類和含量,具有分離效能高、選擇性強(qiáng)、靈敏度高、使用方便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。雖然目前沒有錄入《中國藥典》,但是越來越多的研究表明此法應(yīng)用前景較大,是一種值得推廣的方法。