烙灸療法通過Fas/FasL信號通路對髓核細胞凋亡的調(diào)節(jié)機制

馬蘭潔,楊忠明,許建峰,田 良,林瑞珠,童 昕,孫博文,尤 娜,李國豪

(1.寧夏醫(yī)科大學 中醫(yī)學院,寧夏 銀川750004;2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院,寧夏 銀川750004;3.寧夏醫(yī)科大學 回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室,寧夏 銀川750004)

腰椎間盤突出后髓核重吸收(Resorption of herniated lumbar discs,RHLD)是指在沒有外科手術或化學藥物注射干預下通過保守治療出現(xiàn)的自然吸收甚至完全消失的現(xiàn)象[1]。RHLD理論給中醫(yī)藥等保守療法防治腰椎間盤突出癥帶來新的啟示[2-3]。

我們前期實驗發(fā)現(xiàn):烙灸療法不僅可以促進大鼠RHLD模型椎間盤的重吸收,促使突出髓核細胞的凋亡,還可以導致髓核組織中IL-1和Caspase-3的高表達。由此我們提出烙灸療法可能是通過介導Fas/FasL信號通路促進腰椎間盤突出后髓核重吸收的假說。因此,本研究旨在闡明烙灸療法通過Fas/Fas L信號通路對髓核細胞凋亡的調(diào)節(jié)機制,進一步探討烙灸對腰椎間盤突出后髓核重吸收具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選擇健康Sprague-dawley(SD)大鼠120只,雄性,體重300g,寧夏醫(yī)科大學動物中心提供,動物飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心。動物合格證號:SCXK(寧)2011-0001。標準條件下飼養(yǎng),每日自由攝取純水和標準飼料飼養(yǎng)。實驗前喂養(yǎng)5天以適應環(huán)境,經(jīng)觀察無異常后,按體重由輕到重進行編號(1~120號),然后采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包將大鼠隨機分成4組:烙灸組、拮抗劑組、模型對照組和空白對照組每組各30只。除空白對照組30只大鼠以外,其余90只大鼠按腰椎間盤突出后髓核重吸收造模。

1.1.2 實驗試劑 TUNEL試劑盒、DAB顯色試劑、蘇木素染液、蘇木素分化液、蘇木素返藍液、PBS緩沖液、蛋白酶K、破膜液均購于Servicebio公司;無水乙醇、中性樹膠購于國藥集團化學試劑有限公司;二甲苯購于上海凌峰化學試劑有限公司。

1.1.3 實驗設備 組化筆、載玻片、掌上離心機、脫色搖床、渦旋混合器均購于Servicebio公司;脫水機購于DIAPATH公司;包埋機、凍臺購于武漢俊杰電子有限公司;病理切片機購于上海徠卡儀器有限公司;組織攤片機購于金華市科迪儀器設備有限公司;移液槍購于Dragon公司;顯微鏡、成像系統(tǒng)購于日本尼康公司;灸法所用艾絨購于寧夏醫(yī)藥公司[豫鄭食藥監(jiān)械(準)字2012第1270003號]。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模 (1)尾椎切除:采用公認尾椎椎間盤腰椎硬膜外埋置的造模方法,烙灸組、拮抗劑組和模型對照組90只SD大鼠,20%烏拉坦(1 mL/100 g)經(jīng)腹腔行注射麻醉,麻醉成功后,剃除尾部體毛,用橡皮筋扎住大鼠尾部,并進行常規(guī)消毒。無菌條件下,每只大鼠均切取包括2個完整間盤長度的尾椎,需包含上下軟骨終板。用針刺破上下終板,使髓核暴露,造成游離狀態(tài)或破裂狀態(tài)。用7號手術線進行“米”字形包繞,切取尾椎后放入生理鹽水器皿中備用。

(2)腰椎造模:大鼠腰椎的皮膚剃毛后常規(guī)消毒,無菌條件下沿后正中線后路切開背部皮膚、皮下組織及腰背筋膜,沿棘突剝離骶棘肌,用縫合線分開肌肉組織暴露腰椎,去掉L2-5椎板,露出腰椎硬膜。將取出的尾椎間盤小心放置在腰椎硬膜外,并取可吸收的明膠海綿貼在移植髓核表面,逐層縫合。烙灸組、拮抗劑組和模型對照組的大鼠從造模1月后進行干預,6月后進行取材。

1.2.2 治療方法 (1)烙灸組:30只大鼠從造模1月后進行干預。固定在固定器上,沿大鼠腰椎縱軸方向進行剃毛,將特制的2 cm×0.5 cm×0.5 cm長方體鐵制灸具以腰椎縱軸方向放置,覆蓋L1-L6椎體表面,將鐵制灸具的中心放置在大鼠L3-L4間隙,然后將灸槽內(nèi)2 g艾絨點燃,經(jīng)燃燒的艾絨可以使鐵制灸具發(fā)熱,并將熱量向下傳導使局部皮膚出現(xiàn)潮紅,1次/d,每次10min。干預6月后進行取材。

(2)拮抗劑組:30只大鼠從造模1月后進行干預,首先在大鼠腹腔內(nèi)注射抗Fas抗體,10μg/kg/week,烙灸干預方法同烙灸組,干預6月后進行取材。

(3)模型對照組:30只大鼠造模1月后在固定器上固定10min,每天1次,不予其他干預,固定6月后進行取材。

(4)空白對照組:30只大鼠不予造模和干預,6月后處死并進行取材。

1.2.3 取材 實驗大鼠采用空氣靜脈栓塞法處死,取出埋置在腰椎硬膜外的尾椎椎間盤并剔除周圍軟組織,先行大體觀察并記錄,后用0.9%氯化鈉注射液沖洗,一個放入4%中性甲醛溶液(p H=7.4)中固定1 d,10%EDTA脫鈣3月,梯度酒精脫水,石蠟包埋,常規(guī)切片。

1.2.4 TUNEL細胞凋亡檢測 嚴格按照TUNEL試劑盒操作,二甲苯溶液脫蠟清洗,逐級酒精水化;加入蛋白酶K工作液孵育,滴加100μL TUNEL的反應混合物,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中孵育,滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液染色,脫水,用蘇木素復染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。在熒光顯微鏡下觀察實驗各組的變化情況。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行大鼠分組和數(shù)據(jù)分析,采用ONE-ANOVY對TUNEL法檢測的結果進行方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 髓核細胞凋亡的檢測結果

采用髓核細胞的原位末端標記法(TUNEL法)檢測實驗各組尾椎間盤髓核細胞的凋亡情況,空白對照組凋亡指數(shù)為0,模型對照組為(20±5),烙灸組為(55±5),拮抗劑組為(30±5),模型對照組、拮抗劑組與烙灸組的髓核細胞凋亡指數(shù)明顯高于正常對照組(P<0.05),而烙灸組的髓核細胞凋亡指數(shù)高于模型對照組及拮抗劑組(P<0.05)。以上數(shù)據(jù)提示,烙灸療法可以促進大鼠椎間盤髓核細胞的凋亡。結果見圖1及圖2。

圖1 各組髓核細胞凋亡形態(tài)組織學表現(xiàn)

圖2 各模型組間TUNEL陽性細胞數(shù)

3 討論

近幾年,腰椎間盤突出癥發(fā)病趨于年輕化,長期的久坐久站均會導致疼痛加重,伴有下肢的放射痛,嚴重影響患者的健康,是骨傷科的常見病、多發(fā)病。腰椎間盤突出的患者保守治療無效時,唯一的治療方式是手術切除,這將加劇家庭和社會的經(jīng)濟負擔,同時給患者造成嚴重的心理負擔和身體創(chuàng)傷。而烙灸療法具有活血化瘀、利水消腫的功效,與其他保守治療相比,具有明顯的促進突出的髓核重吸收的作用,從而降低腰間盤突出癥的復發(fā)率。烙灸療法是中醫(yī)化膿灸的發(fā)展與深化,具有刺激面積大、施灸量可控、患者容易接受等優(yōu)點,在臨床中對腰椎間盤突出后髓核重吸收的療效較為突出。

腰椎間盤突出后髓核重吸收的中醫(yī)病因病機為肝腎不足,寒邪、濕邪等六淫侵襲,致氣滯血瘀,不榮則痛,發(fā)為腰痛,烙灸療法具有溫陽補腎、溫經(jīng)散寒、活血化瘀、利水消腫的作用,古代醫(yī)家發(fā)現(xiàn)艾葉性味辛散,易于走竄,方便熱力穿透肌膚而溫通經(jīng)絡、祛風散寒、除濕止痛;《本草綱目》中記載艾葉能“溫中,逐冷,除濕”;《名醫(yī)別錄》謂其能“主灸百病”。根據(jù)“菀陳則除之”“寒者熱之、虛則補之”的治療原則,烙灸施灸量大、熱刺激強烈時可使皮膚破損形成膿瘍,當破潰內(nèi)“惡潤”流出體外,發(fā)揮活血化瘀、利水消腫的功效,以達到治療LDH髓核脫出的目的。髓核脫出組織是一個封閉的無血供組織,具有一定的自身免疫抗原,而當髓核組織游離于椎管內(nèi)時,在烙灸干預下,促進其充分參與血運,使其更容易發(fā)生自身免疫反應,從而產(chǎn)生TNF-a和IL-1β等炎癥因子,以激活Fas/FasL信號通路,誘發(fā)髓核細胞凋亡,加速髓核組織降解,促進腰椎間盤突出后髓核重吸收。

腰椎間盤突出后髓核重吸收現(xiàn)象的機制有多種學說,自身免疫、炎性反應、新生血管化、基質(zhì)代謝平衡失調(diào)、椎間盤退變及髓核細胞凋亡等在重吸收的機制中發(fā)揮重要作用[4]。椎間盤突出后巨噬細胞浸潤可伴有多種細胞因子釋放,如IL-l、HIF-1、MCP-1等,這些細胞因子可通過多條信號通路(如Fas/FasL、MAPKs、NF-kappa B等)參與到生理活動的調(diào)節(jié),并有可能在重吸收中發(fā)揮作用[5]。但是,目前認為Fas/Fas L信號通路可能是調(diào)控髓核細胞凋亡的重要通路之一,并且艾灸和針刺治療都可以調(diào)控該信號通路[5、6]。

Fas又稱Apo-1、CD95或TNFSF6,最初由Yonehara等在一種誘導細胞凋亡的單克隆抗體中發(fā)現(xiàn)[7],Park等在腰椎間盤細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了Fas的表達,且表達程度隨椎間盤突出類型不同而各異[8],目前大部分學者認為,FasL在退變椎間盤中的表達呈下降趨勢,且髓核細胞表達的FasL對椎間盤具有保護作用[9],為Fas信號通路在髓核組織重吸收的研究奠定了重要的基礎。Fas的配體FasL(又稱CD95L、CD178)于1993年由Suda等從細胞毒性T細胞雜交瘤PC60-d10S細胞系中成功克隆[10],其屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族,在細胞中主要以膜結合和可溶性兩種方式存在[11]。因此,Fas信號通路是調(diào)控細胞凋亡的主要途徑[12,13]。

有研究發(fā)現(xiàn)正常髓核組織中僅有Fas L的表達,突出的椎間盤組織中存在FasL、Fas、TNF-a和IL-1的表達,而且表達指數(shù)在破裂型組與非破裂型組之間差異有統(tǒng)計學意義[14]。前期研究表明回醫(yī)烙灸療法可以增加髓核組織中IL-1和Caspase-3的表達,而IL-1和Caspase-3是Fas/Fas L信號通路上下游重要作用因子[15]。Han等認為,Fas L能通過上調(diào)髓核細胞中Fas的表達而促進髓核細胞凋亡,且凋亡與FasL呈劑量依賴性[16]。Fasl與Fas結合后與細胞質(zhì)連接蛋白的N端死亡域、Fas相關 死 亡 域(FADD)結合,通過半 胱 天 冬 酶 原-8(procaspase-8)的信號接受,最終形成死亡誘導信號復合物(Death-inducing signaling complex,DISC)。在半胱天冬酶-8(caspase-8)的啟動后,激活下游的效應蛋白半胱天冬酶-3(caspase-3),引起蛋白酶水解和相關酶聯(lián)反應,從而降解DNA,最終誘導細胞凋亡[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)烙灸組的髓核細胞凋亡指數(shù)高于模型對照組及拮抗劑組(P<0.05),模型對照組的髓核細胞凋亡指數(shù)與拮抗劑組相比無明顯差別,不具有統(tǒng)計學意義。說明烙灸療法可以促進大鼠椎間盤髓核細胞的凋亡,從而減輕患者疼痛,提高了腰椎間盤突出癥患者的生活質(zhì)量,并且烙灸治療簡、便、易、廉,適宜臨床推廣,可節(jié)約大量的醫(yī)療費用和衛(wèi)生資源[3]。