藍(lán)莓真菌病害種類鑒定

覃 可

（貴陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550081）

藍(lán)莓又稱“越橘”，不僅富含常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分，而且還含有極為豐富的黃酮類和多糖類化合物，因此又被稱為“水果皇后”和“漿果之王”[1]。國(guó)外在藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了兩種主要的葉斑病，即Septoria albopunctata引起的殼孢子病和Gloeosporium minus引起的炭疽病。二者都會(huì)減少花芽，影響葉片光合作用，進(jìn)而降低果實(shí)產(chǎn)量[2-7]。在我國(guó)遼東地區(qū)的藍(lán)莓種植基地，葉斑病發(fā)生最早，侵染最廣，損失最大，而藍(lán)莓本身的其他病害在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。2006年9月中旬，在遼東地區(qū)的藍(lán)莓種植地發(fā)現(xiàn)了一種葉斑病[8]。經(jīng)鑒定，該病原菌為Alternaria tenulssima，不僅會(huì)引起葉片病害，而且會(huì)在侵染植株的莖上形成潰瘍區(qū)。此外，據(jù)國(guó)外報(bào)道[9]，該病原菌還可引起果實(shí)采后病害[10]。2006年夏季，遼寧省東部地區(qū)發(fā)生了嚴(yán)重的葉斑病，對(duì)4～6月齡的幼苗危害較大，該病害嚴(yán)重影響了幼苗的培育，經(jīng)調(diào)查，該病原菌是由棒孢桿菌引起的，其真菌寄主范圍廣，可寄生植物約50多科，特別是棕櫚樹、喬木、番石榴和茶樹等經(jīng)濟(jì)作物；受害植物主要表現(xiàn)為葉斑、腐爛、潰瘍等癥狀，嚴(yán)重危害經(jīng)濟(jì)作物，給國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)巨大損失[10]。目前已經(jīng)報(bào)道的病害種類有僵果病、莖潰瘍病和枝條枯萎病、葉斑病、枯焦病毒、花葉病、紅色輪狀斑點(diǎn)病等，但是貴陽(yáng)地區(qū)種植的藍(lán)莓病害未見報(bào)道。因此，調(diào)查和鑒定藍(lán)莓病害種類，可為今后的藍(lán)莓病害防治工作奠定基礎(chǔ)，并為找到防治方法和途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

在貴陽(yáng)市馬鈴鄉(xiāng)藍(lán)莓基地、惠水縣好花紅鄉(xiāng)藍(lán)莓基地、麻江縣藍(lán)莓基地進(jìn)行病害調(diào)查，采集癥狀典型的新鮮病株供室內(nèi)鑒定。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

對(duì)于病株病原菌的分離采用常規(guī)組織分離法[11]。從發(fā)病的植株上剪下病葉或病莖后，沖洗干凈，在葉片或莖部的病健交界處切取1 mm～2 mm×1 mm～2 mm的小塊組織，用70%乙醇消毒30 s，再用0.1%濃度的升汞溶液消毒1 min～3 min，然后用無(wú)菌水沖洗3次，每次1 min～2 min，將小組織放在滅菌后的濾紙上待干。在無(wú)菌條件下將病害組織接在PDA培養(yǎng)基的平板上。經(jīng)2 d～3 d后，PDA長(zhǎng)出菌絲后，對(duì)菌絲進(jìn)行分離提純。經(jīng)顯微鏡觀察排除掉雜菌，挑取菌絲進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)用于提取DNA并把菌絲保存于斜面培養(yǎng)基上。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

觀察純化病原菌菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地以及分生孢子產(chǎn)生與否，對(duì)產(chǎn)生分生孢子器的病原菌制作切片，觀察分生孢子器、分生孢子形狀、顏色等，參照《真菌分類鑒定手冊(cè)》[12]進(jìn)行。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

以ITS1和ITS4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后得到ITS區(qū)序列經(jīng)Blast并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性比較。

1.2.4 致病性測(cè)定

分離純化后的菌種根據(jù)柯赫氏法則用針刺的方法刺傷藍(lán)莓健株的葉片將菌絲接種在葉片上。另備上用無(wú)菌水做處理的對(duì)照組CK。經(jīng)24 h、48 h、72 h進(jìn)行觀察。再將在自然條件下發(fā)病的葉片與在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)做回接試驗(yàn)發(fā)病后的葉片進(jìn)行比較，在體視鏡下對(duì)各自的病斑觀察對(duì)比，如病害癥狀特點(diǎn)一致且在顯微鏡下觀察得到分離后的病原菌與自然發(fā)病條件下的病原菌一致，即能確定病害。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害種類鑒定

2.1.1 藍(lán)莓銹病

病害癥狀：受害葉片上早期出現(xiàn)小的斑點(diǎn)，后葉片正面形成大的斑點(diǎn)，葉背面產(chǎn)生明黃色粉末狀小點(diǎn)，為銹孢子。病葉變黃，早期脫落。病菌以菌絲體在檜柏病組織內(nèi)越冬，春季遇雨水冬孢子吸水膨脹，借雨水傳播侵染藍(lán)莓幼嫩組織，檜柏是其中間轉(zhuǎn)主寄主[13]。

病原菌：真菌病害，病原為Pucciniastrum vaccinii.，屬擔(dān)子菌亞門膨痂銹菌屬。夏孢子堆葉背生，淡赭色；擬包被半球形，由長(zhǎng)形而小的有或無(wú)隔膜的細(xì)胞組成，高50μm~90μm，直徑100μm~125μm；夏孢子上有疏疣，近球形或往往是矩圓形、橢圓形、卵形或梨形，近無(wú)色，25μm~30μm×10μm~18μm。冬孢子堆葉背生，在寄主的表皮下，赭色，殼狀；冬孢子淡色，2~8胞，近球形或矩圓形，17.5μm~32μm×12μm~25μm。

2.1.2 藍(lán)莓枝枯病

病害的癥狀：高發(fā)于幼枝。該病主要發(fā)生在傷口和切口，受害初期會(huì)產(chǎn)生紅棕色斑點(diǎn)，隨著斑點(diǎn)的擴(kuò)大，枝條開始干枯，逐漸導(dǎo)致整個(gè)幼枝死亡。在發(fā)病后期，易在病斑上產(chǎn)生密集的小黑斑（分生孢子）。切開受害組織后，維管束組織變成淺棕色，可見白色菌絲體[14]。

病原菌：為棒孢擬盤多毛孢真菌（Pestalotiopsis clavispora.）。自然感染枝上的孢子載體為分生孢子，黑色，單腔，初散生，埋入寄主表皮下，再經(jīng)表皮暴露，直徑50μm～100μm；產(chǎn)孢細(xì)胞呈棒狀，無(wú)色，末端產(chǎn)生分生孢子。分生孢子平直或稍彎，有4個(gè)隔膜，5個(gè)細(xì)胞，分隔處稍縊縮，中隔明顯，21.7μm～25.1μm×5.7μm～6.3μm；頂端細(xì)胞呈錐形，無(wú)色，長(zhǎng)3.1μm～3.5μm，基部細(xì)胞呈倒錐形，無(wú)色，第2和第3細(xì)胞為深褐色，壁厚，長(zhǎng)11.1μm～11.9μm。第四個(gè)細(xì)胞呈極淺橄欖色，壁厚，長(zhǎng)5.5μm～5.9μm，頂端有2～4根細(xì)長(zhǎng)絲，長(zhǎng)23.8μm～27.2μm，基部有1根細(xì)長(zhǎng)絲，長(zhǎng)4.9μm～6.5μm。分生孢子平均長(zhǎng)寬比為3.3～3.914。序列長(zhǎng)度為506 bp，與棒孢擬盤多毛孢Pestalotiopsis clavispora.同源性為100%，登錄號(hào)為gb KP075005.1。

2.1.3 藍(lán)莓葉枯病

病害癥狀：主要為害葉片，葉片上出現(xiàn)黃褐色小斑，呈圓形或不規(guī)則形，葉片邊緣褐色，中央灰白色，有明顯的同心輪紋，并產(chǎn)生濃黑色小粒點(diǎn)，病界明顯，邊緣有明顯的暗色壞死帶。

病原菌：為韋斯梅擬盤多毛孢真菌(Pestalotiopsis vismiae.)，屬半知菌亞門腔孢綱黑盤孢目。分生孢子直或稍彎曲，具4個(gè)隔膜，5個(gè)細(xì)胞，分隔處稍縊縮，中間橫隔明顯，頂端細(xì)胞呈錐形，基部細(xì)胞呈倒錐形，無(wú)色；頂端附屬絲2～4根，基部無(wú)附屬絲。序列長(zhǎng)度為461 bp，與韋斯梅擬盤多毛孢Pestalotiopsis vismiae.同源性為100%，登錄號(hào)為gb KP747698.1。

2.1.4 藍(lán)莓根腐病

病害癥狀：幼苗至成株期均可發(fā)生，苗圃幼苗發(fā)生危害重，主要為害根部。毛細(xì)根先出現(xiàn)壞死斑，后整個(gè)根系變褐腐爛枯死。植株生長(zhǎng)緩慢，葉片變黃、干枯，最后植株死亡。定植1～2年的植株也有發(fā)生。

病原菌：為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum.）。菌落突起絮狀，菌絲白色質(zhì)密。菌落粉白色，淺粉色至肉色，略帶有紫色，由于大量孢子生成而呈粉質(zhì)。菌落高3 mm～5 mm，小型分生孢子著生于單生瓶梗上，常在瓶梗頂端聚成球團(tuán)，單胞，卵形；大型分生孢子鐮刀形，少許彎曲，多數(shù)為3隔。厚垣孢子尖生或頂生，球形[15]。氣生菌絲、黏孢團(tuán)、子座、菌核、均呈各種顏色。菌絲與大型分生孢子上有時(shí)有厚垣孢子，厚垣孢子間生或頂生，單個(gè)或多個(gè)成串或成結(jié)節(jié)狀[16]。序列長(zhǎng)度為491 bp，與尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum.同源性為100%，登錄號(hào)為gb KU056819.1。

2.1.5 藍(lán)莓灰霉病

病害癥狀：開始從葉尖或葉緣處發(fā)病，形成“V”病斑向葉內(nèi)擴(kuò)散。后期病葉卷曲干枯，被灰色霉層包裹。果實(shí)上初呈水漬狀小點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)果實(shí)干癟變黑密生灰色霉層[17]。

病原菌：為灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。菌落初為白色，質(zhì)密，隨著菌絲增長(zhǎng)顏色加深變成深灰綠色，老熟時(shí)呈灰褐色，菌絲絲絨狀，約7 d在培養(yǎng)基周圍及底部形成灰褐色菌核孢子梗細(xì)長(zhǎng)，直立有隔膜，分生孢子梗無(wú)色或淡色，123μm～287μm×10μm～14μm，有分支，頂端膨大成圓形，分生孢子著生于小梗上，分生孢子卵圓形或橢圓形，單細(xì)胞，無(wú)色或淡色透明。分生孢子8μm~14μm×7μm~11μm[17]。序列長(zhǎng)度為510 bp，與灰葡萄孢Botrytis cinerea.同源性為100%，登錄號(hào)為gb KR055051.1。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)調(diào)查，貴陽(yáng)市馬鈴鄉(xiāng)藍(lán)莓基地、惠水縣好花紅鄉(xiāng)藍(lán)莓基地、麻江縣藍(lán)莓基地發(fā)現(xiàn)為害藍(lán)莓的主要真菌病害為藍(lán)莓銹病(Pucciniastrum vaccinii.)、藍(lán)莓枝枯病(Pestalotiopsis clavispora.)、藍(lán)霉葉枯病(Pestalotiopsis vismiae.)、藍(lán)莓根腐病(Fusarium oxysporum.)、藍(lán)莓灰霉病(Boteytis cinerea.)。藍(lán)莓引種不久，貴州省內(nèi)種植年限較短，管理栽培方法較好，因此，并沒(méi)有發(fā)生嚴(yán)重的病害流行傳播，對(duì)產(chǎn)量影響小。目前各地以打造生態(tài)藍(lán)莓種植基地為目的，藍(lán)莓基地病害防治主要以生物防治手段為主，但是單靠栽培管理及肥水管理的農(nóng)業(yè)防治不能徹底根除病害。鑒于藍(lán)莓在我國(guó)是一個(gè)新的樹種，在嚴(yán)格把好檢疫關(guān)的同時(shí)，應(yīng)借鑒國(guó)外多年研究成果，積極開展我國(guó)藍(lán)莓病蟲害發(fā)生規(guī)律和防治措施研究，減少病蟲害在我國(guó)發(fā)生。