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    單載體吸附微生物的研究

    2021-12-25 08:22:48楊明月
    中國乳業(yè) 2021年11期
    關(guān)鍵詞:鋸末珍珠巖麥麩

    王 格,楊 萌,楊明月,魯 琳*

    1 北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 101300

    2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206

    0 引言

    固定化微生物技術(shù)(Imobilized Microorganlsins)是20世紀(jì)60年代在固定化酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù),隨著遺傳工程、細(xì)胞工程、酶催化工程等高新技術(shù)的成熟發(fā)展和促進(jìn),目前已成為生物工程領(lǐng)域的一個(gè)重要分支[1]。固定化微生物具有微生物密度大、反應(yīng)速度快、低污泥產(chǎn)量、耐環(huán)境沖擊和反應(yīng)過程容易控制等優(yōu)點(diǎn),吸引眾多國內(nèi)外學(xué)者對其研究。相較于固定化酶技術(shù),固定化細(xì)胞技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)勢,也使得固定化細(xì)胞技術(shù)能夠迅速發(fā)展及完善[2]。

    一般載體會選擇顆粒小、疏松、比表面積大并且pH值為中性(不足中性的用前調(diào)整到中性)的物質(zhì)。載體不僅對于一定時(shí)間內(nèi)維持菌劑中特定的微生物的活性、數(shù)量有十分重要的作用,還是決定菌劑質(zhì)量的重要因素之一,將影響應(yīng)用效果。但是即便采用相同的培養(yǎng)基和相同單位數(shù)量的載體,若固定化的方法不同,菌體與載體的結(jié)合方式以及結(jié)合程度也將會有所不同。因此,雖然能夠作為載體的材料很多,但并非隨便一種物質(zhì)都可以作為菌劑載體的材料。據(jù)研究報(bào)道[3,4],載體的種類、數(shù)量、大小、結(jié)構(gòu)、形狀等物理性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征對白腐真菌的培養(yǎng)及應(yīng)用均有較大的影響作用。

    吸附法是將細(xì)胞直接吸附于惰性載體上,分為物理吸附法和離子結(jié)合法。物理吸附法是利用硅藻土、多孔磚、木屑等材料作為載體,將微生物細(xì)胞吸附住;離子結(jié)合法是利用微生物細(xì)胞表面的靜電荷在適當(dāng)條件下可以為離子交換樹脂進(jìn)行離子結(jié)合和吸附制成固定化細(xì)胞。吸附法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、載體可再生;缺點(diǎn)是細(xì)胞與載體的結(jié)合力弱,pH值和離子強(qiáng)度等外界條件的變化都可以導(dǎo)致細(xì)胞的解吸,使其從載體上脫落。

    一部分學(xué)者認(rèn)為在堆肥過程中沒有必要接種菌劑,但還有大多數(shù)人認(rèn)為,在人工條件下通過接種菌劑可以提高堆肥的微生物數(shù)量并加快堆肥反應(yīng)進(jìn)程。且早在20世紀(jì)40年代,美國就通過接種細(xì)菌從而使堆肥時(shí)間縮短了1~3 天。許多研究結(jié)果也充分肯定了接種菌劑在堆肥過程中的促進(jìn)作用,所以,有不少學(xué)者已開始著力研究在堆肥不同階段起關(guān)鍵作用的微生物,并開始進(jìn)行自然界中的優(yōu)質(zhì)高效菌群的篩選以及接種技術(shù)的探討。

    本試驗(yàn)從不同發(fā)酵狀態(tài)的廢棄物中篩選獲得的、纖維素酶活性較高的自選菌種,進(jìn)行了單載體的吸水率、吸菌量,菌劑固定后的過氧化氫酶和纖維素酶的變化研究,為后續(xù)復(fù)合載體吸附微生物的試驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    本課題組保存,從不同發(fā)酵狀態(tài)的廢棄物中篩選獲得的纖維素酶活性較高的自選菌種:真菌ZZ9、細(xì)菌ZX5及ZH9。

    載體:麥麩(MF)、鋸末(JM)、干牛糞(GNF)、硅藻土(GZT)、蛭石(ZS)、珍珠巖(ZZY)、草炭(CT)。

    1.2 試驗(yàn)儀器

    滅菌鍋、超凈工作臺、-80 ℃冰箱、搖床、培養(yǎng)箱、烘箱。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 單載體的吸水量測定

    在無菌條件下將菌液與各載體充分混勻,每次加入5.0 mL菌液。使載體濕潤,并保持疏松,且不結(jié)塊。以菌劑所含的菌液量為載體吸水率,吸水率反映載體的吸附能力。

    1.3.2 單載體的吸菌量測定

    將菌劑放置在陰涼處保存,兩天后取l0.00 g樣品加入100 mL生理鹽水在200 r/min下振蕩2 h,然后立即用稀釋平板計(jì)數(shù)法測定釋放的菌數(shù)。

    1.3.3 單載體吸菌后條件優(yōu)化

    (1)菌劑制作

    在500 mL三角瓶中裝入200 mL培養(yǎng)液,將ZX5、ZZ9、ZH9分別接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中。

    真菌的培養(yǎng)基為改良的高氏一號培養(yǎng)基:葡萄糖10.0 g,蛋白胨5.00 g,硝酸鉀1.00 g,氯化鈉0.50 g,磷酸氫二鉀0.50 g,硫酸鎂0.50 g,硫酸亞鐵0.01 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.2~7.4。

    細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3.00 g,蛋白胨5.00 g,氯化鈉5.00 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0~7.2。

    在25 ℃下靜置培養(yǎng)至對數(shù)期。

    (2)載體制作稱量三角瓶子重量m1,分別稱量各種載體大約100.00 g于三角瓶中,于0.1 MPa,滅菌20 min后,放于烘箱中在60 ℃下烘干48 h直到衡重,稱重為m2,由此得到載體凈重。按載體的吸水率,分別向載體中加入相應(yīng)菌液量,放于30 ℃下儲存。分別在其第1、3、5、9、12、15、30天測定其纖維素酶酶活及過氧化氫酶酶活。

    (3)酶活測定

    a、纖維素酶活性測定(硝基水楊酸比色法)

    葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)液含0.2~0.8 mg葡萄糖)繪制:分別取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL移入25.0 mL容量瓶中,加3.0 mL二硝基水楊酸溶液。將試管放在沸騰水浴上5 min,然后迅速冷卻3 min。定容,15 min后在分光光度計(jì)上于波長540 nm處比色測定。以光密度值為縱坐標(biāo),以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    操作步驟:稱1 g菌劑于50.0 mL三角瓶中,加20 mL 1%羧甲基纖維素溶液、5.0 mL pH值為5.5磷酸鹽緩沖液及1.5 mL甲苯,將三角瓶放在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后,過濾并定容25.0 mL。取1.0 mL濾液,然后按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色法比色測定。纖維素酶活,以72 h,10.00 g土壤生成葡萄糖毫克數(shù)表示。

    b、過氧化氫酶活性測定

    酶液提取:取10.0 mL試管4 支,2 支為樣品測試管,2 支為對照,各管分別加入粗酶液0.2 mL。磷酸緩沖液(0.2 M,pH值7.8)1.5 mL,水1.0 mL。對照管加入的酶液為沸水浴中保持2 min的酶液。

    活性測定:25 ℃預(yù)熱后,逐管加入0.3 mL的H2O2溶液(0.1 M),每加完一管立即計(jì)時(shí),并迅速測定其在240 nm下的吸光值,每隔1 min讀數(shù)1 次,共測4 min,待4 支試管全部測完后,計(jì)算其過氧化氫酶酶活。

    以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1 個(gè)酶活單位:過氧化氫酶活性=(△A240·VT)(0.1V1·t·wF)-1

    式中:A0為對照管加入煮死酶液吸光值;A1、A2為樣品管吸光值;VT為粗酶液提取液總體積(mL);V1為測定用粗酶液體積(mL);wF為樣品鮮重(g);0.1為A240每下降0.1為1 個(gè)酶活單位;t為加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間(min)

    2 試驗(yàn)結(jié)果

    2.1 單載體的吸水率

    載體的吸水率越高,表明對菌的吸附能力越強(qiáng)。從表1可以看出,鋸末、珍珠巖、硅藻土的吸水率比較高,也就說明這3 種載體的吸附能力比較好,對菌的吸附能力較強(qiáng),吸水率依次是鋸末>珍珠巖>硅藻土。其中,吸水率最高的鋸末是吸水率最低的草炭的5.7 倍,也是吸水率第2高的珍珠巖的1.2倍。但載體的選擇還應(yīng)看隨著時(shí)間的增長,其對菌的釋放力,菌劑在載體上的存活時(shí)間以及菌劑的活力如何。

    表1 單載體的吸水率

    2.2 單載體的吸菌量

    由圖1可以看出,載體對于ZX5的吸附能力普遍較強(qiáng),能達(dá)到1.0×1010~2.0×1010CFU/g,其中鋸末、珍珠巖以及硅藻土的表現(xiàn)比較優(yōu)秀;ZZ9次之,普遍在1.0×1010g,其中也是鋸末、珍珠巖、硅藻土的表現(xiàn)比較好;而對于ZH9的吸附能力則很弱,只有1.0×109g左右,鋸末、珍珠巖和硅藻土的表現(xiàn)較為突出。這也驗(yàn)證了吸水率較好的載體對于菌的吸附性也很好。

    圖1 單載體的吸菌量

    2.3 菌劑固定后的過氧化氫酶變化

    過氧化氫酶(Catalase)又叫接觸酶,可以促進(jìn)堆肥中有機(jī)物的氧化分解。過氧化氫是代謝過程中產(chǎn)生的廢物,會對機(jī)體造成一定損害,因此,必須迅速將過氧化氫轉(zhuǎn)化為其他無害或毒性較小的物質(zhì)。而過氧化氫酶便是用與催化細(xì)胞中的過氧化氫分解的工具,幾乎所有的生物機(jī)體都存在過氧化氫酶,其酶促活性為機(jī)體提供了抗氧化防御機(jī)理。本研究通過測定各菌種固定后的過氧化氫酶活性,各菌種固定后隨著儲存時(shí)間延長,其酶活性的變化表現(xiàn)不同。據(jù)此將3 種菌固定在7 種載體上的酶活變化:菌種ZH9和ZZ9,二者固定在麥麩及干牛糞上的過氧化氫酶活性變化呈現(xiàn)“山峰”型,即均經(jīng)歷了先升高再降低的過程,并且其酶活性在第2~4 天達(dá)到最高峰。

    由圖2可以看出,菌ZH9在麥麩及干牛糞上的過氧化氫酶活性較高,尤其是在麥麩上的表現(xiàn)較好。在第4天幾乎所有載體的過氧化氫酶活性均出現(xiàn)峰值,隨后都開始降低,除麥麩外的載體在第5天以后活性都接近0;而在麥麩上的過氧化氫酶活性則逐漸降低,在第7天的時(shí)候活性才消失。

    圖2 ZH9的過氧化氫酶活性

    由圖3可以看出,菌ZZ9在麥麩上的過氧化氫酶活性表現(xiàn)較為突出,其次為干牛糞,但在第4天以后幾乎所有載體上ZZ9的過氧化氫酶活性都幾乎為0,只有干牛糞上的過氧化氫酶活性持續(xù)性較好,穩(wěn)定性也較好。

    圖3 ZZ9的過氧化氫酶活性

    由圖4可以看出,菌ZX5在載體上的過氧化氫酶活性相對于其他菌劑來說普遍不高。ZX5在干牛糞上的過氧化氫酶活性較其他載體一直偏高,在第3天時(shí)出現(xiàn)峰值??傮w來說,ZX5菌的過氧化氫酶活性普遍較高。

    圖4 ZX5的過氧化氫酶活性

    2.4 菌劑固定后的纖維素酶變化

    纖維素酶(Cellulase)是酶的一種,在分解纖維素的過程中起生物催化作用。細(xì)菌、真菌、動物體內(nèi)等都可以產(chǎn)生纖維素酶。纖維素是地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物,占全球植物總干重的30%~50%,是植物細(xì)胞壁的主要成分[5]。而且纖維素還是牛糞堆肥原料中比較難分解的成分,它可在纖維素酶作用下水解為纖維二糖,進(jìn)而水解為葡萄糖[6]。本研究纖維素酶活性是以72 h后1 g肥生成的葡萄糖mg數(shù)表示。

    由圖5可以看出,菌ZH9在麥麩上的纖維素酶活性比較高,其走勢呈現(xiàn)一種先下降后緩慢上升的過程;在鋸末上的纖維素酶活性次之,但相對來說比較平穩(wěn)。在其他載體上的活性幾乎為0。而在接種初始階段,該菌在麥麩與鋸末上的纖維素酶活性較高;而在接種的最后階段亦是這兩種載體上的纖維素酶活性較高。

    圖5 ZH9的纖維素酶活性

    由圖6可以看出,菌ZZ9在麥麩上的纖維素酶活性表現(xiàn)較好,其走勢經(jīng)歷一個(gè)先下降后緩慢上升的的變化,并在最后達(dá)到其高峰。而該菌在其他載體上表現(xiàn)一般,其纖維素酶活性都接近0。

    圖6 ZZ9的纖維素酶活性

    由圖7可以看出,菌ZX5的纖維素酶活性在麥麩上的表現(xiàn)最為突出,其酶活經(jīng)歷了一個(gè)先下降,后上升的過程,并在接種的最后達(dá)到了峰值。該菌在鋸末上的表現(xiàn)次之,其纖維素酶活性較之麥麩偏低,但其酶活的變化不是很顯著,比較平穩(wěn)。而其他幾種載體顯然不適合ZX5菌的保存及再繁,其纖維素酶活性幾乎為0。

    圖7 ZX5的纖維素酶活性

    3 結(jié)論

    在過氧化氫酶酶活的測定中,麥麩及干牛糞的表現(xiàn)均比較優(yōu)秀且3 種菌都在第6~8天的時(shí)候出現(xiàn)峰值。在纖維素酶酶活的測定中,亦是麥麩與干牛糞的表現(xiàn)較為突出,而在后期接到麥麩上的3 種菌的纖維素酶酶活都大幅度提高,可能是到后期載體中的營養(yǎng)物質(zhì)比較少,微生物便開始分泌纖維素酶消化載體中的纖維素。

    綜上所述,從單載體試驗(yàn)中可以挑出以下4 種適合ZX5、ZZ9、ZH9三種菌吸附的載體:麥麩、硅藻土、干牛糞及鋸末。因此,在復(fù)合載體的試驗(yàn)中,表現(xiàn)比較好的有機(jī)載體麥麩可以為微生物提供所需要的營養(yǎng),而鋸末的吸水性較好且疏松透氣,適合作為載體的支架物質(zhì),3 種菌在干牛糞因其蓬松,富含有機(jī)質(zhì)的特點(diǎn)表現(xiàn)相對較好,尤其將干牛糞作為載體可以縮短其接種到牛糞后的適應(yīng)期,而硅藻土則主要作為無機(jī)載體來吸附微生物。

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