基于血管病變探討麥門冬湯治療系統(tǒng)性硬化癥小鼠的作用機制?

劉紫微， 王振亮△， 楊偉超， 謝 莎

(1.河南中醫(yī)藥大學， 鄭州 450046； 2.仲景宛西制藥股份有限公司， 鄭州 450046)

系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)是一種自身免疫性疾病，以皮膚增厚、組織或器官的局限性或彌漫性纖維化為主要臨床表現(xiàn)，80%左右的患者以肢端雷諾現(xiàn)象為首發(fā)癥狀，最終累及內(nèi)臟出現(xiàn)心、肺和消化道器官病變，常見肺間質(zhì)纖維化及肺動脈血管病變[1]。目前其發(fā)病機制尚未明確，研究表明血管內(nèi)皮細胞損傷和活化是SSc發(fā)病的關鍵，受累組織廣泛的血管病變是本病的病理學特征之一。血管病變常累及小動脈、微細動脈和毛細血管，因血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的增生導致血管腔狹窄，進而出現(xiàn)血行瘀阻。

以往研究主要集中于麥門冬湯對SSc患者纖維化與免疫系統(tǒng)的影響。經(jīng)實驗表明，麥門冬湯能通過提高CD4+、CD8+、T細胞含量調(diào)節(jié)SSc小鼠的免疫機制[2]，而血管病變的相關研究缺如。本次研究通過觀察麥門冬湯對SSc小鼠血管病變的改善作用，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。本研究已通過河南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查，批號DWLL201808071。

1 材料

1.1 動物

SPF級75只BALB/c雌性小鼠，體質(zhì)量(20±5) g，5周齡，北京維通利華實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物實驗室，溫度(21±2)℃，相對濕度40%～60%。

1.2 藥物

麥門冬湯組成：麥門冬60 g，人參6 g，半夏9 g，甘草4 g，大棗15 g，粳米6 g，由河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院中藥飲片房提供，煎煮濃縮至含生藥1 g/mL。麥門冬湯低、中、高劑量組給藥量分別為6.5/(kg·d)、13.0/(kg·d)、26.0 g/(kg·d)，以20 g小鼠和70 kg成人體表面積折算系數(shù)(0.0026)換算。

1.3 主要試劑及儀器

博萊霉素(Bleomycin，BLM，貨號621158)，上海生工生物工程股份有限公司；血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF，貨號EIA-2409)、小鼠抗內(nèi)皮細胞自身抗體(anti-endothelial cell antibodies，AECA，貨號EIA-2285)、血栓素B2(thromboxane B2，TXB2，貨號EIA-2540)、6-酮前列腺素F1α(6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α，貨號EIA-2177)、ELISA定量試劑盒，蘇州艾萊薩生物科技有限公司；蘇木素染色液(貨號G1140)、伊紅染色液(貨號G1100)，北京索萊寶科技有限公司。

DL-5B型離心機(上海安亭科學儀器廠)；DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)；BL29-DG5031型標準酶標儀(北京中世遠達商貿(mào)有限公司)；LEICAEG1150型組織包埋儀(上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)；LEICAST5020型組織染色機(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)；BX51TRF型顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；LGG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱(合肥艾本森科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

75只BALB/c雌性小鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組15只和造模組60只。制備SSc小鼠模型，用10%硫化鈉溶液脫去小鼠背部中央皮膚區(qū)域1 cm2×1 cm2的毛發(fā)并標記注射區(qū)域，正常組小鼠每日皮下注射0.1 mL PBS，造模組每日皮下注射0.1 mL BLM注射液(200ug/mL )，持續(xù)21 d。造模成功后，與正常組小鼠比較，造模組小鼠注射部位皮膚顯著增厚、硬化，皮損區(qū)無新生體毛。成模小鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、麥門冬湯低、中、高劑量組各15只。麥門冬低、中、高劑量組分別灌胃相應劑量的麥門冬湯，正常組和模型組灌胃同樣體積的蒸餾水，于每天上午9∶00及下午5∶00灌胃，連續(xù)21 d。實驗結束時正常組剩余小鼠14只，模型組13只，麥門冬湯低、中、高劑量組各15只。

2.2 標本采集

各組于末次灌胃后禁食不禁水24 h，摘眼球采血法取血，每只小鼠獲得全血樣本約1 mL，離心后分離出血清和血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆?。頸椎脫臼法處死小鼠，剪取背部備皮區(qū)皮膚，打開胸腔摘取雙側肺臟，迅速浸入10%多聚甲醛固定。

2.3 指標檢測與方法

2.3.1 一般情況觀測 觀測各組小鼠的體質(zhì)量、色澤、食量以及精神狀態(tài)、活動情況、造模部位皮膚變化等情況。

2.3.2 蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色觀察小鼠肺組織與皮膚病理形態(tài)學變化 各組分別選取厚度為1 cm的固定肺組織，將肺組織和皮膚組織放入包埋盒中，脫水后運用組織包埋儀進行石蠟包埋，切取3 μm的組織切片進行HE染色，封片后光鏡下觀察小鼠皮膚及肺組織結構。

2.3.3 ELISA檢測 嚴格按照ELISA試劑盒說明書描述方法測定血清中AECA以及血漿中vWF、TXB2、6-keto-PGF1α濃度。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組小鼠一般情況

給藥治療后與模型組比較，麥門冬湯低、中、高劑量組皮損程度均得到一定程度改善，其皮膚硬化程度緩解，彈性有所恢復，個別小鼠皮損區(qū)有新生體毛，麥門冬湯高劑量組效果最明顯。

3.2 各組小鼠皮膚、肺組織病理學比較

圖1示，正常組小鼠皮膚正常，無真皮層增厚及棘細胞層增生，未見膠原纖維增生，無炎癥細胞浸潤。模型組小鼠真皮層及棘細胞層明顯增厚，膠原纖維明顯增生，可見明顯炎性細胞浸潤。與模型組比較，麥門冬湯高、中劑量組真皮層及棘細胞層增厚，膠原纖維增生和炎性細胞浸潤程度明顯減輕，麥門冬湯低劑量組無明顯改變。

圖1示，正常組小鼠肺泡結構正常，肺血管壁無增厚、無炎性細胞浸潤及纖維化改變。模型組小鼠肺泡間隔明顯增厚，部分肺泡萎陷、消失，肺血管壁明顯增厚，肺間質(zhì)增厚，大量膠原纖維增生并伴炎癥細胞浸潤。與模型組比較，麥門冬湯高、中劑量組肺血管壁和肺間質(zhì)增厚，膠原纖維增生以及炎癥細胞浸潤程度明顯改善，麥門冬湯低劑量組無明顯改變。

圖1 麥門冬湯對SSc小鼠皮膚、肺組織病理影響比較(HE×200)

3.3 各組小鼠血中AECA、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α含量比較

表1示，與正常組比較，模型組小鼠血中AECA、vWF、TXB2含量均明顯升高(P<0.05)，6-keto-PGF1α因子含量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，麥門冬湯低、中、高劑量組AECA、vWF、TXB2含量均有不同程度降低(P<0.05)，6-keto-PGF1α含量均有不同程度升高(P<0.05)，其中麥門冬湯高劑量組效果最為明顯。

表1 麥門冬湯對小鼠血中AECA、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α含量影響比較

4 討論

本研究以“肺朝百脈，輸精于皮毛”為切入點，研究系統(tǒng)性硬化癥引起的血管病變，通過觀察皮膚與肺組織病理切片，檢測AECA、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α的含量，為中醫(yī)治療自身免疫性疾病提供實驗依據(jù)及治療思路。

根據(jù)SSc的臨床表現(xiàn)，其屬于中醫(yī)學“皮痹”范疇[3]，皮毛失養(yǎng)是其主要病機。皮毛發(fā)揮正常的生理功能有賴于衛(wèi)氣、津液以及血液的溫潤與濡養(yǎng)，而衛(wèi)氣的宣發(fā)、津液輸布以及血液運行皆與肺胃密切相關。衛(wèi)氣、津血皆為脾胃納運水谷所化之精微，通過肺氣宣降外達布散滋養(yǎng)于皮毛。肺胃之性皆喜潤惡燥，胃津不足，腐熟通降無權，衛(wèi)氣、津血化生失常，不足以濡潤皮毛；肺熱津涸，宣降失常，不能行衛(wèi)于表、敷津于膚、運血于皮，且肺朝百脈失常，行血力弱易生瘀滯；若久病不愈則更易感邪。正如《素問·痹論篇》所言：“皮痹不已，復感于邪，內(nèi)舍于肺?！丙滈T冬湯為治療“氣火上逆，肺胃陰虛”證的代表方劑，用于治療肺胃津液耗傷、虛火上炎、熏灼于肺之證。方中麥門冬為君，以甘寒清潤之性益肺胃之陰以清其虛熱；人參為臣補脾益肺、益氣生津；粳米補中益氣兼止煩渴；大棗養(yǎng)胃健脾補中；生甘草清熱補脾潤肺、調(diào)和諸藥，三者配伍與人參相佐，共以“培土生金”之法使肺津源泉不竭；少佐溫燥之半夏，降氣止逆之余又防滋膩壅滯[4]。諸藥并用共奏清養(yǎng)肺胃、降逆下氣之功，胃和脾運則衛(wèi)氣津血源泉不竭，肺潤宣通則氣暢津布、血行暢運，衛(wèi)氣津血達散無阻。

SSc是以自身免疫和炎癥、眾多血管床中的小血管功能和結構異常導致皮膚和臟器進行性間質(zhì)改變以及血管纖維化為主要特征[5]。由自身免疫反應導致的血管損傷是SSc發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，血管內(nèi)皮細胞(endothelial cells，EC)是其發(fā)病的主要靶細胞[6]。AECA是一種以EC表皮異質(zhì)性抗原為靶標，通過補體介導或抗體依賴細胞毒性破壞血管內(nèi)皮細胞，以致血管損傷的自身免疫性抗體，是反映血管內(nèi)皮細胞受損和血管炎的分子標志物[7]，其細胞外基質(zhì)成分被發(fā)現(xiàn)與雷諾現(xiàn)象和SSc密切相關[8]。AECA介導內(nèi)皮細胞和皮膚成纖維細胞活化，導致SSc的發(fā)生并定義了SSc的進程[9]。vWF是一種主要由EC合成的高分子血漿糖蛋白，在黏附聚集血小板于受損內(nèi)皮過程中具有關鍵作用[10]，既是血管內(nèi)皮損傷的一個敏感指標[11]，又是激活凝血機制的重要因素。血管內(nèi)皮損傷后，vWF起首要作用，受損血管的內(nèi)皮下成分首先與血液循環(huán)中的vWF結合，介導血小板的黏附，擴大血小板聚集，使抗纖溶因子釋放增多，纖溶系統(tǒng)被抑，同時利于凝血酶生成，加強凝血機制，導致微循環(huán)障礙[12-14]。有研究表明，在風濕病并發(fā)雷諾現(xiàn)象的發(fā)病機制中，vWF表達水平與雷諾現(xiàn)象發(fā)生率呈正相關，且vWF釋放越多SSc患者預后越差[11]。血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)是血小板合成的強血管收縮劑和血小板聚集誘導劑，前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)是EC合成的強血管擴張劑和血小板聚集抑制劑。血管內(nèi)皮未受到損傷時兩者保持動態(tài)平衡，以維持血管的正常張力；血管損傷后使得止凝血與抗凝血機制失調(diào)，血管壁PGI2合成酶活性受抑則PGI2生成減少，血小板聚集則TXA2合成增高，且TXA2/PGI2比例失調(diào)[9,15]。由于TXA2和PGI2生物半衰期極短，TXB2與6-keto-PGF1α是TXA2與PGI2迅速轉化形成的穩(wěn)定而無生物活性的一對調(diào)節(jié)血管舒縮因子，所以一般通過測定血漿中TXB2和6-keto-PGF1α間接反映其含量[16]。SSc患者血管異常收縮痙攣、血液呈高凝狀態(tài)是發(fā)生雷諾現(xiàn)象的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，SSc患者的TXB2含量顯著升高，6-keto-PGF1α顯著降低，且TXB2/6-keto-PGF1α數(shù)值越高則患者雷諾現(xiàn)象越嚴重[17]。故TXB2和6-keto-PGF1α與SSc關系密切，以兩者的含量反映SSc引起的血管損傷程度極具意義。

本研究表明，麥門冬湯可能通過降低血清中AECA的含量，阻礙AECA與EC結合，防止EC被破壞，從而減輕血管損傷；可能通過減少血漿中vWF與TXB2含量，增加6-keto-PGF1α含量，減輕血管內(nèi)皮血小板聚集與血管痙攣收縮，促進纖溶抑制血栓的形成，從而緩解微循環(huán)障礙，減輕由SSc引起的雷諾反應。麥門冬湯的劑量濃度與治療效果存在一定的量效關系，表明麥門冬湯濃度越高治療效果越好，但何時達到最佳療效仍有待進一步研究。實驗時通常要設置陽性對照組，以證明此治療方法優(yōu)于或等效其他藥物，因此確定麥門冬湯治療系統(tǒng)性硬化癥的最優(yōu)劑量濃度，且是否優(yōu)于現(xiàn)已知的臨床常規(guī)治療藥物是進一步研究的方向。綜上所述，麥門冬湯治療SSc機制之一可能與減輕血管損傷、緩解SSc患者血管病變有關。