雙參活血顆粒對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)急性心肌梗死大鼠自噬的影響?

張嘉敏， 楊 鶯

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)， 沈陽(yáng) 110847； 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 沈陽(yáng) 110032)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是全球范圍內(nèi)具有較高發(fā)病率和死亡率的疾病之一[1]。自噬是真核生物細(xì)胞中普遍存在的一種生理現(xiàn)象，是機(jī)體在營(yíng)養(yǎng)缺乏或應(yīng)激條件下發(fā)生的適應(yīng)性反應(yīng)，在多重壓力下自噬通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)無(wú)用大分子蛋白和受損細(xì)胞器，降解多余產(chǎn)物以維持細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)的穩(wěn)定，完成對(duì)細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的供給，滿(mǎn)足機(jī)體新陳代謝需要。此外，自噬還具有參與多種人類(lèi)疾病發(fā)展過(guò)程的生物功能[2]。適當(dāng)?shù)男募〖?xì)胞自噬被證實(shí)可減輕心肌重構(gòu)，維護(hù)正常的心功能，應(yīng)對(duì)急性缺血缺氧等有害刺激以及保護(hù)受損心肌細(xì)胞，使其避免發(fā)生急性缺血性死亡；異常的自噬可增加心肌細(xì)胞死亡風(fēng)險(xiǎn)，加速心肌梗死的進(jìn)程甚至加重心力衰竭[3]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路在心肌細(xì)胞自噬調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。根據(jù)心肌梗死發(fā)生時(shí)的表現(xiàn)特點(diǎn)，其屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”“厥心痛”范疇，某些益氣活血藥可通過(guò)抑制自噬的過(guò)度表達(dá)，保護(hù)缺血缺氧狀態(tài)下的心肌細(xì)胞防治缺血性心臟病[5]。本文通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討以益氣養(yǎng)陰、活血通脈功能為主的雙參活血顆粒對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的急性心肌梗死大鼠心肌自噬的影響，為臨床中醫(yī)藥調(diào)控自噬治療心血管疾病的研究提供參考。本研究已通過(guò)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，批號(hào)21000092019041。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量300～340 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(遼)2015-0001。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，無(wú)菌飲水及飼料清潔級(jí)喂養(yǎng)7 d，適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行心肌梗死大鼠模型制備。

1.2 藥物

雙參活血顆粒藥物組成：人參10 g，黃芪20 g，麥冬15 g，當(dāng)歸15 g，丹參15 g，川芎20 g，桃仁15 g，紅花15 g。采用傳統(tǒng)顆粒制備方法，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供。鹽酸曲美他嗪片由施維雅(天津)制藥有限公司生產(chǎn)，20 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字20055465。

1.3 主要試劑與儀器

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)WLA004)、ECL檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)WLA003)、β-actin(WL01845)、PI3K(WL02240)、Akt(WL0003b)、mTOR(WL02477)、p-Akt(WLP001a)、p-mTOR(WL03694)抗體，購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司；p-PI3K抗體(貨號(hào)AF3241)，中國(guó)Affinity公司。

DYY-7C型電泳儀(北京六一公司)；H-2050R型超速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀公司)；ELX-800型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIOTEK公司)；DH36001B型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特公司)；HL-B6型小動(dòng)物呼吸機(jī)(北京新利科技有限公司)；MAC1200ST型心電圖機(jī)(美國(guó)GE公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為正常組(0.9%氯化鈉溶液3 mL/次)8只和造模組52只，造模成功后存活40只隨機(jī)分為模型組(0.9%氯化鈉溶液3 mL/次)、西藥組(鹽酸曲美他嗪片1.90 mg/kg)、中藥高劑量組(7.92 g/kg)、中藥中劑量組(3.96 g/kg)、中藥低劑量組(1.98 g/kg)每組各8只，用藥劑量按照動(dòng)物體表面積換算，造模成功后次日上午8時(shí)開(kāi)始灌胃給藥，每日1次，分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，共連續(xù)觀察2周后處死。

2.2 模型制備方法

造模大鼠禁食12 h，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射，麻醉成功后仰臥位固定，氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，針狀電極插入四肢連接心電監(jiān)測(cè)儀，術(shù)中記錄大鼠標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。鈍性分離胸骨左緣肌肉組織后，于胸骨左側(cè)第3肋間逐步剪開(kāi)肋間肌暴露心臟，在左心耳下緣2～3 mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支,以Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段明顯抬高>0.1 mV至少15 min為造模成功標(biāo)志(圖1)。迅速將心臟送回胸腔,確認(rèn)無(wú)出血后依次縫合胸壁，抽出胸腔積氣積液，待大鼠恢復(fù)自主呼吸后停止呼吸機(jī)，送回鼠籠繼續(xù)飼養(yǎng)。

圖1 造模前后大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖變化

2.3 指標(biāo)檢測(cè)與方法

Western Blot法檢測(cè)自噬信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá):取各組大鼠缺血心肌組織加入裂解液，冰上靜置5 min，離心后取上清，采用BCA比色法定量檢測(cè)蛋白含量。分別配置8%、10%、12%、15%的分離膠進(jìn)行電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，封閉結(jié)束后漂洗，與相應(yīng)的PI3K(1∶500)、p-PI3K(1∶1000)、Akt (1∶500)、p-Akt(1∶500)、mTOR(1∶500)、p-mTOR(1∶500)、β-actin(1∶1000)一抗反應(yīng)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜4次，加二抗(1∶5000)37 ℃孵育45 min，TBST充分漂洗后ECL曝光，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)Gel-Pro-Analyzer軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析，各組與內(nèi)參β-actin比較得出相對(duì)光密度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

圖2表1示，與正常組比較，模型組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，PI3K、Akt、mToR蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，各藥物組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.05)，其中西藥組上調(diào)最為顯著，中藥低、中、高劑量組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達(dá)具有劑量依賴(lài)性，PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠心肌組織中PI3K 、Akt、mTOR及磷酸化蛋白表達(dá)灰度值比較

注：A.正常組；B.模型組；C.中藥高劑量組；D.中藥中劑量組；E.中藥低劑量組；F.西藥組；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)，蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)

4 討論

冠狀動(dòng)脈堵塞是造成心肌梗死的主要原因，這種堵塞致使冠狀動(dòng)脈血流供應(yīng)減少，持續(xù)性缺血缺氧，從而引起心肌功能損傷和不可逆的壞死，嚴(yán)重威脅患者的生命安全。近年來(lái)，中醫(yī)藥調(diào)控自噬治療心血管疾病相關(guān)研究日漸廣泛，多種中藥活性成分、多條信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)，并可參與自噬的調(diào)控機(jī)制[6]。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是調(diào)控自噬最為經(jīng)典的通路。PI3K根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同主要分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，Ⅰ型PI3K是觸發(fā)mTOR通路的必要環(huán)節(jié)，發(fā)揮激活mToR蛋白而抑制自噬的作用；Ⅱ型PI3K不作為細(xì)胞表面受體下游的經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子，具體功能尚存在爭(zhēng)議；Ⅲ型PI3K則具有可與多種蛋白結(jié)合組成復(fù)合體共同參與細(xì)胞自噬的功能[7]。Akt是

一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，共有Akt1、Akt2、Akt3 3種亞型，屬于AGC蛋白激酶家族。Akt是PI3K下游的主要作用靶點(diǎn)，活化后的Akt處于PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的核心位置，在細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、代謝等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。mTOR通過(guò)形成mTORC1、mTORC2 2個(gè)不同的復(fù)合物發(fā)揮作用，mTORC1可通過(guò)影響S6K1等下游效應(yīng)因子的磷酸化，參與細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、增殖、分化和自噬的調(diào)控[9]。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在自噬過(guò)程的不同階段可發(fā)生相應(yīng)變化，生理情況下細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)充足，各種細(xì)胞因子等信號(hào)分子首先與酪氨酸激酶受體結(jié)合，進(jìn)而激活I(lǐng)類(lèi)PI3K，之后進(jìn)一步磷酸化PIP2生成PIP3,活化的PIP3作為第二信使將Akt從細(xì)胞質(zhì)聚集至細(xì)胞膜，而不能直接磷酸化Akt，需與磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶-1 (phosphoinositide dependent protein kinase1, PDK1)結(jié)合，從而促使Akt磷酸化，p-Akt可直接或間接將信號(hào)傳至mTOR[10]。mTOR是細(xì)胞自噬進(jìn)程中的主要抑制因子，受PI3K/Akt通路的正向調(diào)控，mTOR收到上游激活信號(hào)后形成mTOR復(fù)合物1(mTOR Complex 1, mTORC1)，激活的mTORC1通過(guò)一系列調(diào)控，抑制自噬啟動(dòng)因子的活性，發(fā)揮抑制自噬的生理效應(yīng)，即PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活，可抑制自噬進(jìn)程[11]。而當(dāng)細(xì)胞受到營(yíng)養(yǎng)缺乏、缺血、缺氧、氧化應(yīng)激等不利因素的刺激時(shí)，均會(huì)抑制PI3K/Akt/mTOR通路中多種激酶的磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬[12]。

正常情況下的心肌細(xì)胞內(nèi)存在著較低水平的自噬，當(dāng)心肌細(xì)胞處于急性缺血缺氧狀態(tài)時(shí)，受營(yíng)養(yǎng)缺乏和氧化應(yīng)激的影響，細(xì)胞的自噬水平會(huì)適應(yīng)性上調(diào)，從而減輕心肌細(xì)胞的損傷，但長(zhǎng)期過(guò)度的自噬可能通過(guò)自我消化加劇心肌細(xì)胞的死亡[13]。目前自噬現(xiàn)象對(duì)缺血心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的具體時(shí)間窗尚不明確。

中醫(yī)認(rèn)為胸痹的本質(zhì)是本虛標(biāo)實(shí)，在心肌梗死的中醫(yī)證型分類(lèi)中,虛證類(lèi)最為常見(jiàn)的證型依次為氣虛、陰虛、陽(yáng)虛等,而實(shí)證類(lèi)以血瘀、痰濁最為多見(jiàn),其次是氣滯、寒凝等，所以氣虛、陰虛、血瘀和痰濁是心肌梗死的主要病理基礎(chǔ)，益氣養(yǎng)陰、活血通脈為胸痹的主要治療原則[14]。本實(shí)驗(yàn)選用雙參活血顆粒，由人參、黃芪、麥冬、當(dāng)歸、丹參、川芎、桃仁、紅花8味藥物組成。方中人參大補(bǔ)元?dú)鉃榫?，臣以黃芪助人參益氣;麥冬滋養(yǎng)心肺；當(dāng)歸補(bǔ)血行血，為血中之氣藥；丹參、川芎、桃仁、紅花活血化瘀、通脈止痛共為佐藥，諸藥共奏益氣養(yǎng)陰、活血通脈之功，正切合病機(jī)。人參皂苷、丹參酚酸B、川芎嗪、黃芪總苷、麥冬皂苷分別是中藥人參、黃芪、丹參、川芎、麥冬的主要活性成分。現(xiàn)代藥理研究表明，這些具有益氣活血的中藥有效成分能夠參與自噬相關(guān)信號(hào)蛋白的調(diào)控，并對(duì)心肌有保護(hù)作用。Qin等[15]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷可通過(guò)PI3K/Akt/mTOR通路保護(hù)受缺氧誘導(dǎo)的損傷心肌細(xì)胞。丹參酚酸B能夠促進(jìn)自噬標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ(Microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ、LC3-Ⅱ)和自噬效應(yīng)蛋白(Beclin-1)的表達(dá)，在急性心肌梗死中發(fā)揮著至關(guān)重要的保護(hù)作用[16]。孫達(dá)[17]等認(rèn)為，川芎嗪能夠激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Phosphatidylinositol 3-kinase/Protein kinase B/Hypoxia Inducible Factor-1α, PI3K/AKT/HIF-1α)信號(hào)通路，改善大鼠急性心肌梗死后心功能損傷和減少心肌細(xì)胞死亡。沈瑩等[18]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芪總苷可通過(guò)mTOR信號(hào)通路抑制細(xì)胞自噬,減輕H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，提高心肌細(xì)胞存活率。本研究采用“冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法” 成功復(fù)制大鼠心肌梗死模型后，模型組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)降低，提示機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)后抑制此條信號(hào)通路活化，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬；經(jīng)鹽酸曲美他嗪、雙參活血顆粒干預(yù)后，各藥物組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯增高，且雙參活血顆粒的干預(yù)劑量與蛋白表達(dá)結(jié)果呈正相關(guān)，提示雙參活血顆?？缮险{(diào)PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平，激活心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制自噬，并隨給藥劑量的增加該通路被激活程度越高。

綜上所述，雙參活血顆?？赡芡ㄟ^(guò)激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制過(guò)度自噬，從而減輕大鼠心肌梗死晚期損傷。本實(shí)驗(yàn)存活大鼠數(shù)量較少，未能實(shí)時(shí)、定量的檢測(cè)各組心肌細(xì)胞自噬活性變化，缺少反映自噬活性對(duì)于心肌細(xì)胞影響的可靠指標(biāo)，雙參活血顆粒如何調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬以及在心肌梗死中發(fā)揮作用都有待進(jìn)一步研究證實(shí)。尋找中醫(yī)藥調(diào)節(jié)自噬有效靶點(diǎn)，明確中醫(yī)藥如何通過(guò)激活適度自噬，抑制過(guò)度自噬而減少自噬性死亡的機(jī)制，明確細(xì)胞自噬在AMI中的具體時(shí)間窗，把握自噬水平高低與治療作用的關(guān)系，將為中醫(yī)藥調(diào)控自噬治療心血管疾病提供新的前景。