小鼠肝炎病毒感染對(duì)shh等基因改造小鼠生殖性能的影響及其相應(yīng)凈化方案

關(guān)升起*

（蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 江蘇·蘇州 215123）

小鼠肝炎病毒（Mousehepatitisvirus，MHV）屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬，為單股RNA病毒，是已知冠狀病毒中體積最大的一個(gè)。其病毒粒子呈球形，外有囊膜，外包膜突起呈放射狀排列。根據(jù)不同的感染嗜性，小鼠常可分為呼吸株和嗜腸株兩型，其中，嗜腸株極少擴(kuò)散至其他組織，而呼吸株可在肝臟與神經(jīng)系統(tǒng)中復(fù)制。多數(shù)情況下，MHV呈隱性感染，但在應(yīng)激因素刺激下，可引發(fā)嚴(yán)重肝炎及神經(jīng)癥狀，并發(fā)展成為急性致死性疾病[1]。

目前，國(guó)內(nèi)外均鮮見(jiàn)關(guān)于MHV感染影響生殖系統(tǒng)功能的報(bào)道，但經(jīng)過(guò)連續(xù)8年對(duì)蘇州大學(xué)外來(lái)隔離檢疫及委托人工輔助生殖小鼠的情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MHV感染顯著影響部分基因改造小鼠的生殖系統(tǒng)功能。由于MHV可通過(guò)胎盤(pán)將病毒從母體向胎鼠垂直傳播，本研究利用小鼠受精3.5天前胚胎外層完整的透明帶的屏障作用，對(duì)患病小鼠采用體外受精+胚胎移植的方法進(jìn)行凈化。結(jié)果表明，凈化得到的小鼠，其生殖系統(tǒng)功能可恢復(fù)至與同背景野生型的平均水平。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

委托我中心進(jìn)行隔離檢疫及凈化保種的基因修飾實(shí)驗(yàn)小鼠；購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司的ICR雄鼠、C57BL/6J供卵小鼠、ICR代孕雌鼠。

1.2 主要試劑

孕馬血清促性腺激素（PMSG）和絨毛膜促性腺激素（HCG）購(gòu)自寧波三生；自配輸卵管液培養(yǎng)試劑（HTF）；Mouse hepatitis virus (MHV)Elisa kit試劑盒購(gòu)自XpressBio公司。

1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）、體視顯微鏡（OLYMPUS）、倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS）、相位差顯微鏡（Leica）、生物顯微鏡溫控儀（南京凱爾）、冰箱（海爾）、精密電子天平（上海舜宇）。

1.4 方法

1.4.1 結(jié)扎雄鼠

ICR雄鼠按照0.6mL/20g體重的劑量腹腔注射1.2%三溴乙醇進(jìn)行麻醉。待小鼠進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)，固定四肢，仰臥位腹部剃毛，在小鼠雙股近心端高點(diǎn)連線于腹中線兩側(cè)對(duì)稱(chēng)剪開(kāi)1cm切口；找到包裹睪丸的脂肪團(tuán)，將脂肪團(tuán)和睪丸一起拉出腹腔；依睪丸位置，找到輸精管，用紅外線加熱器加熱彎口鑷至發(fā)紅，燒灼切斷輸精管；將輸精管、睪丸還納腹腔；依次縫合小鼠的肌層和表皮。將縫合好的小鼠放在待蘇醒籠盒中，籠盒下以溫控儀37℃加熱，等待小鼠復(fù)蘇。小鼠完成結(jié)扎后，單獨(dú)飼養(yǎng)1個(gè)月后方可使用。

1.4.2 供卵鼠的激素處理

本實(shí)驗(yàn)采用胚胎發(fā)育的二細(xì)胞期進(jìn)行移植。鑒于二細(xì)胞胚胎移植的實(shí)驗(yàn)周期為5天，本研究選擇在每周的第一天，即周一開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。周一的17:00，選3-5周健康同背景野生型雌鼠，腹腔注射5IUPMSG；周三17:00，對(duì)已注射過(guò)PMSG的雌鼠，腹腔注射5IU HCG。

1.4.3 精卵體外受精

（1）周四8:00，取待凈化雄鼠，按照0.6mL/20g體重的劑量腹腔注射1.2%三溴乙醇麻醉；仰臥位腹部剃毛，在小鼠雙股近心端高點(diǎn)連線于腹中線兩側(cè)對(duì)稱(chēng)剪開(kāi)1cm切口；剪下附睪尾，放入裝有300 LHTF試劑的0.5mL EP管中。

（2）超凈臺(tái)內(nèi)打開(kāi)EP管，取出附睪尾；將附睪尾放置在高壓滅菌過(guò)的濾紙上，吸取附著的液體、血液和脂肪；左手以顯微鑷夾起附睪尾，右手以顯微鑷緊靠左手顯微鑷夾取附睪尾的位置夾緊，左右手交替重復(fù)操作使附睪尾緩緩繃緊；以耳用探針挑破繃緊的附睪尾外壁，使小鼠精子涌出并在附睪尾外壁形成白色突起；更換新的顯微鑷小心夾取突出附睪尾外壁的頂端精子，放入已經(jīng) CO2平衡過(guò)的HTF液滴，將裝有HTF液滴的平皿放入CO2培養(yǎng)箱中溫育，30min后取出，檢查精子質(zhì)量。

（3）周四8:00，取注射過(guò)PMSG及HCG的供卵雌鼠安樂(lè)死；仰臥位，剪開(kāi)小鼠腹腔，找到小鼠子宮，再沿著子宮找到兩側(cè)的卵巢和輸卵管；在保證輸卵管膨大部完整的情況下，剪下輸卵管，并置于滅菌濾紙上吸干附著于上的血液、脂肪和組織液。

（4）將輸卵管置于已經(jīng)過(guò)CO2平衡過(guò)的HTF液滴的礦物油保護(hù)層中，剝開(kāi)膨大部，挑出帶有卵丘細(xì)胞的小鼠卵細(xì)胞團(tuán)，放入HTF液滴中。

（5）使用移液器，從檢查過(guò)小鼠精子質(zhì)量的液滴邊緣處，吸取6 L小鼠精子，加入小鼠卵細(xì)胞的HTF液滴中，然后，將載有液滴的平皿放入CO2培養(yǎng)箱中溫育6小時(shí)。

1.4.4 胚胎移植

小鼠精子與卵子混合溫育6小時(shí)后，取出載有HTF液滴的平皿，置于顯微鏡下，挑選排出第二極體或形成雄原核的受精卵，以口吸管移入新的HTF液滴，置于CO2培養(yǎng)箱中溫育至次日8:00。

次日8:00，即周五8:00，從CO2培養(yǎng)箱中取出裝有受精卵的HTF液滴，挑選并計(jì)數(shù)二細(xì)胞數(shù)量。麻醉準(zhǔn)備好的與結(jié)扎雄鼠合籠的見(jiàn)栓假孕雌鼠，側(cè)臥位，暴露并固定卵巢和輸卵管，將發(fā)育至二細(xì)胞的受精卵，經(jīng)輸卵管傘部注入小鼠輸卵管的膨大部。逐層縫合，將小鼠放入置于37℃熱臺(tái)上的小鼠籠盒中，護(hù)理小鼠，直至小鼠蘇醒。

1.4.5 小鼠肝炎病毒的檢測(cè)及凈化評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

凈化得到的F1代小鼠發(fā)育至5周齡時(shí)，每胎隨機(jī)選取F1代小鼠1-2只與代孕雌鼠一同使用ELISA法檢測(cè)小鼠肝炎病毒。若檢測(cè)鼠體仍有肝炎病毒存在，則判定凈化結(jié)果為不合格，重新凈化；若鼠體無(wú)肝炎病毒，保留小鼠并擴(kuò)繁，待F2代小鼠發(fā)育至5周齡時(shí)，隨機(jī)選取F2代小鼠再次檢測(cè)，若仍合格，則認(rèn)為凈化成功。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝炎病毒感染整體呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)

對(duì)2012年至2019年送我中心隔離檢疫小鼠及此期間委托我中心進(jìn)行生物凈化小鼠的鼠肝炎病毒患病情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)小鼠肝炎病毒病整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，如圖1（由于疫情影響，2020年送我中心隔離檢疫小鼠與委托凈化小鼠的數(shù)量都大幅減少，故未將2020年的數(shù)據(jù)加入統(tǒng)計(jì)）。

圖1：2012至2019年蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心外源動(dòng)物感染小鼠肝炎病毒與接收凈化情況

2.2 小鼠肝炎病毒感染導(dǎo)致小鼠精子質(zhì)量的下降

通過(guò)對(duì)不同小鼠的精子進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)感染小鼠肝炎病毒的基因改造小鼠，其精子受精能力顯著下降，如圖2。其在體外受精6h時(shí)排出第二極體與形成雄原核（圖2B、2E）的數(shù)量明顯少于相同背景健康的 C57BL/6J野生型（WT）小鼠（圖2A，1號(hào)為第二極體排出階段，2號(hào)為雄原核形成階段），在體外受精24h時(shí)二細(xì)胞（圖2D、2F）占比也明顯少于相同背景健康的C57BL/6J野生型（WT）小鼠（圖2C）。

圖2：患病基因改造小鼠精子的精卵結(jié)合率情況

2.3 小鼠肝炎病毒感染導(dǎo)致小鼠繁殖周期延長(zhǎng)

通過(guò)對(duì)凈化前后小鼠的繁殖周期進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)感染小鼠肝炎病毒的小鼠，其繁殖周期明顯延長(zhǎng)；而凈化后的小鼠，其繁殖周期可恢復(fù)至同環(huán)境同背景的健康C57BL/6J野生型小鼠（WT）水平，如圖3。

圖3：小鼠凈化前后繁殖周期對(duì)比

2.4 小鼠肝炎病毒感染導(dǎo)致小鼠每胎產(chǎn)仔數(shù)減少

通過(guò)對(duì)凈化前后小鼠的每胎產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)感染小鼠肝炎病毒的小鼠，其每胎產(chǎn)仔數(shù)明顯減少；而凈化后的小鼠，其每胎產(chǎn)仔數(shù)可恢復(fù)至同背景的健康C57BL/6J野生型小鼠（WT）水平，如圖4。

圖4：小鼠凈化前后每胎產(chǎn)仔數(shù)對(duì)比

2.5 小鼠肝炎病毒感染導(dǎo)致小鼠的每胎離乳數(shù)減少

通過(guò)對(duì)凈化前后小鼠的每胎離乳數(shù)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)感染小鼠肝炎病毒的小鼠，其每胎離乳數(shù)明顯降低；而凈化后的小鼠，其每胎離乳數(shù)可恢復(fù)至同背景的健康C57BL/6J野生型小鼠（WT）水平，如圖5。

圖5：小鼠凈化前后每胎離乳數(shù)對(duì)比

3 討論

根據(jù)以往的報(bào)道，小鼠肝炎病毒（MHV）可引起腦膜腦炎、脊髓炎、肝炎、視神經(jīng)炎，可引發(fā)視神經(jīng)軸突丟失和脫髓鞘[3,4]。目前，此病毒常分為呼吸株（respiratory MHV strain）和嗜腸株（enterotropicMHVstrain）。呼吸株 MHV，即，MHV-1、MHV-2、MHV-3、MHV-JHM(MHV-4)、MHVA59，和MHV-S毒株，最初在鼻呼吸和嗅覺(jué)上皮中復(fù)制，隨后可傳播至肺、肝、骨髓、腦、淋巴組織和生殖系統(tǒng)器官，并在其中復(fù)制。嗜腸株，即MHV-D、MHV-DVIM、MHVY，和MHV-RI毒株，主要感染腸道，偶爾可擴(kuò)散到肝臟，淋巴組織和脾臟[5,6]。呼吸株和嗜腸株的小鼠肝炎病毒在多數(shù)情況下均呈隱性感染；少數(shù)情況下，MHV在應(yīng)激因素刺激也可導(dǎo)致急性致死性疾病，在臨床上通?？煞譃榧毙愿窝仔秃蜕窠?jīng)型。

目前，雖然有MHV可感染生殖細(xì)胞的報(bào)道，但有關(guān)小鼠肝炎病毒影響小鼠生殖繁育能力的報(bào)道尚鮮有見(jiàn)到。

本研究根據(jù)連續(xù)8年對(duì) MHV單一感染小鼠進(jìn)行比較，分析發(fā)現(xiàn)MHV很可能也會(huì)對(duì)某些基因改造小鼠的繁殖性能產(chǎn)生顯著影響。如：相比于同背景健康C57BL/6J野生型小鼠（WT）繁殖周期的66.09±18.39天，MHV感染后的基因改造小鼠的繁殖周期延長(zhǎng)至110.78±23.97天。而相比于同背景健康C57BL/6J野生型小鼠（WT）平均每胎產(chǎn)仔5.45±1.29只，MHV感染后的基因改造小鼠的每胎產(chǎn)仔數(shù)僅為2.00±1.20只。

導(dǎo)致患病小鼠繁殖周期延長(zhǎng)的原因，可能是此株MHV入侵神經(jīng)系統(tǒng)使雄鼠性欲降低（這種推測(cè)通過(guò)小鼠合籠后雌鼠的陰道栓和陰道涂片進(jìn)行分析，但目前此部分的數(shù)據(jù)并不完整，無(wú)法進(jìn)行分析）。而導(dǎo)致患病小鼠平均每胎產(chǎn)仔數(shù)下降的原因，很可能是由于此株MHV感染降低了雄性小鼠的精子質(zhì)量。研究通過(guò)對(duì)比 WT小鼠與患病小鼠精子體外受精6小時(shí)有效受精卵占比和體外受精24小時(shí)二細(xì)胞占比，發(fā)現(xiàn)患病小鼠6小時(shí)有效受精卵占比和體外受精24小時(shí)二細(xì)胞占比，均明顯（平均百分比分別為 36.48±12.53%和 21.02±9.57%）低于 WT 小鼠的66.94±11.91%和59.08±7.32%。這說(shuō)明，至少在精子的體外受精能力方面，患病雄性小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了顯著的下降。

至于同背景健康C57BL/6J野生型小鼠（WT）平均每胎離乳小鼠4.73±1.49只，患病小鼠的平均每胎離乳數(shù)僅為1.09±1.57只（個(gè)體差異巨大導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差大于平均值）的情況，則很可能是MHV對(duì)哺乳期仔鼠的致死作用所導(dǎo)致的。

同時(shí)，研究也發(fā)現(xiàn)，以體外受精+胚胎移植的方式對(duì)患病小鼠進(jìn)行凈化是有效的。根據(jù)比較凈化前后的基因改造小鼠的繁殖能力，發(fā)現(xiàn)凈化后的小鼠，其平均繁殖周期可由患病中的110.78±23.97天縮短至65.89±23.33天，平均每胎胎產(chǎn)仔數(shù)可由患病中的 2.00±1.20只提高至5.24±1.56只，平均離乳數(shù)可由患病中的1.09±1.57只提高至 5.08±1.41只。

綜上，雖然MHV對(duì)生殖系統(tǒng)的具體致病機(jī)理尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)小鼠精子受精率的阻礙作用是顯著的。這可能意味著MHV出現(xiàn)了新的病毒株，也可能意味著已發(fā)現(xiàn)的MHV毒株，在感染部分基因改造小鼠后，可使其產(chǎn)生顯著的生殖功能抑制。

下一步研究，將對(duì)致生殖能力下降的病毒株進(jìn)行完整測(cè)序，以判斷其是否發(fā)生了變異，并加強(qiáng)MHV對(duì)更多不同實(shí)驗(yàn)小鼠的研究。