鋅脅迫下甘藍型油菜發(fā)芽期下胚軸長的全基因組關聯(lián)分析

魏麗娟 申樹林 黃小虎 馬國強 王曦彤 楊怡玲 李洹東 王書賢 朱美晨 唐章林 盧 坤 李加納 曲存民

西南大學農學與生物科技學院 / 油菜工程研究中心 / 西南大學現(xiàn)代農業(yè)科學研究院, 重慶 400715

近年來, 土壤重金屬污染問題愈發(fā)嚴重, 對人類身體健康和生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生重大影響[1]。鋅是植物生長發(fā)育所必需的微量元素之一, 適量鋅可促進植物生長發(fā)育, 增強植物對不良環(huán)境的適應性[2-3]。然而過度使用不僅會造成嚴重的環(huán)境污染, 還會降低土壤微生物的活性, 減緩土壤有機質的分解, 進而影響植物根的生長和光合作用[4-6]。油菜被認為是修復重金屬(如Cu、Cd、Zn)污染土壤的理想植物之一[7-10], 對鋅具有高耐受性, 在鋅脅迫下仍可獲得較高的生物產(chǎn)量[7,11]。曹春信等[12]通過研究油菜地上部器官對鋅富集的特征發(fā)現(xiàn), 鋅在莖稈中的含量大于籽粒。挖掘耐鋅性關鍵位點和候選基因對耐鋅性油菜品種的培育具有重要意義, 全基因組關聯(lián)分析被廣泛應用于作物重金屬抗性位點的檢測。Zhang等[13]利用全基因組關聯(lián)分析方法, 在水稻中共檢測到 31個耐鋅QTL位點。Chen等[14]利用BrassicaIllumina 60K SNP芯片進行全基因組關聯(lián)分析, 檢測出25個甘藍型油菜耐鎘QTL位點, 并找到NRAMP6、IRT1、CAD1和PCS2四個候選基因。Zhang等[15]檢測到4個甘藍型油菜耐鎘位點, 并鑒定出一些候選基因,如HIPP27、EXPB4、EMB1793和CDSP3。曲存民等[16]檢測到 70個甘藍型油菜耐砷性的顯著關聯(lián)位點, 并篩選出PHT3;3和PHT1;9等與甘藍型油菜砷離子吸收轉運相關的候選基因。超富集植物對重金屬的積累和耐性機制研究也取得了一定進展, 許多蛋白參與鋅的吸收、轉運和貯存, 包括CDF (Cation Diffusion Facilitator)蛋白家族[17]、NRAMP蛋白家族[18]、ZIP蛋白家族[19]、HMA 蛋白家族(P-type ATPases)[20]、YSL (yellow stripe-like)蛋白家族[21]、ABC (ATP-binding cassette)轉運蛋白家族[2,22]。但關于甘藍型油菜耐鋅性QTL定位和候選基因鑒定并未見相關報道。

為挖掘甘藍型油菜與耐鋅性狀相關聯(lián)的關鍵位點及候選基因, 本研究采用GWAS方法獲得與下胚軸長顯著關聯(lián)的SNP標記, 結合轉錄組數(shù)據(jù)獲得鋅脅迫前后差異表達基因, 進一步確定影響下胚軸長的關鍵候選基因。本研究不僅為甘藍型油菜耐鋅性種質資源的鑒定提供分子標記, 而且可以為耐鋅性油菜資源利用和新品種培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為國內外收集的甘藍型油菜自交系品種140份, 其中國內材料123份, 主要來自重慶、四川、湖北、湖南等地, 其余17份材料來自加拿大和德國等國家, 所有材料由西南大學重慶市油菜工程技術研究中心收集并提供。

1.2 試驗處理與性狀分析

從 140份研究材料中隨機抽取10份材料(附表1), 分別用 0、5、10、15、20、30和 50 mg L-1濃度的 Zn(NO3)2進行處理, 比較分析發(fā)現(xiàn), 處理濃度為30 mg L-1時材料間長勢差異較大, 確定為最佳處理濃度(表1)。試驗分為對照組和處理組, 重復3次, 挑選大小均勻、飽滿的種子各 100粒, 分別播種于對照純水和 30 mg L-1的 Zn(NO3)2溶液處理的培養(yǎng)盤(長 37.0 cm × 寬 24.5 cm × 高 6.5 cm, 體積為 4.5 L),覆蓋保鮮膜。生長條件為晝夜溫度為 25℃, 光照/黑暗時間為 16 h/8 h, 光照強度為 100 μmol m–2s–1, 相對濕度為60%[23]。播種7 d后, 選取長勢一致的5株幼苗, 分別測量對照和鋅脅迫下的下胚軸長(hypocotyl length, HL)。將處理和對照的相對值作為衡量鋅脅迫對甘藍型油菜生長的影響[24], 記為相對下胚軸長(relative hypocotyl length, RHL)。計算公式: 相對性狀值(%)=處理組測定值/對照組測定值×100%[16]。利用 Microsoft Excel 2013繪制正態(tài)分布圖, 利用 SPSS統(tǒng)計分析軟件進行偏度和峰度分析。

1.3 基因型分析及SNP標記定位

利用蕓薹屬60K SNP芯片, 參照Qu等[25-26]方法, 對 140份材料進行基因型分析, 去掉最小基因型頻率(minor allele frequency, MAF)低于 0.05和SNP得率(call frequency)小于 80%的標記。為確定SNP在染色體上的位置, 利用探針序列與基因組進行BLASTN比對, E-value設定為1e?5。去掉Bit-Score相同的SNP, 最終獲得30,288個SNP標記用于群體性狀的關聯(lián)分析。

1.4 群體結構分析與親緣關系

利用STRUCTURE軟件進行甘藍型油菜群體結構分析[27], 組群數(shù)目(K)設定為1～10,K值運行5次(number of iterations), 將MCMC (Markov Chain Monte Carlo)不作數(shù)迭代(length of burn-in period)和不作數(shù)迭代后的MCMC全部設為100,000次, 在混合模型下進行運算。最后用運算得到的后驗概率值和 2個連續(xù)的后驗概率值的變化速率(ΔK)來確定群體中存在的亞群數(shù)目[28]。利用SPAGeDi v1.4軟件進行親緣關系(relative kinship)分析, 并計算親緣關系的矩陣[29]。

1.5 全基因組關聯(lián)分析及候選基因鑒定

利用 TASSEL 5.0軟件[30]中的一般線性模型(General Linear Model, GLM)和混合線性模型(Mixed Linear Model, MLM), 結合 SNP芯片基因型數(shù)據(jù),以Q值和親緣關系K值作為協(xié)變量, 進行全基因組關聯(lián)分析, 確定關聯(lián)位點和標記對表型變異的解釋率(R2)。本研究采用了6種模型進行關聯(lián)分析, 包括GLM中的naive、Q和PCA模型, MLM中的K、Q+K和 PCA+K模型。根據(jù)每個 SNP位點的-log10(P)觀察值和期望值, 利用 R軟件(https://www.r-project.org/)繪制Quantile-Quantile散點圖(QQ plot)。曼哈頓圖(Manhattan plot)利用 R語言程序包的 mrMLM(Multi-Locus Random-SNP-Effect Mixed Linear Model)進行繪制[31]。與性狀顯著關聯(lián)的SNP位點的閾值為P< 3.30×10-5, 計算方法為: 1/N(N=30,288)[16]。利用 TASSEL 5.0軟件[30]計算 linkage disequilibrium (LD)在油菜不同染色上的分布情況,確定不同染色體的LD衰減距離, 根據(jù)LD確定候選基因區(qū)間。

1.6 甘藍型油菜鋅脅迫轉錄組測序

取甘藍型油菜自交系07191鋅脅迫處理前和處理7 d后的幼苗, 于液氮中保存, 參照曲存民等[16]方法提取總RNA, 利用Illumina Hiseq 2500進行轉錄組測序, 以甘藍型油菜為參考基因組[32], 利用Cuffdiff篩選差異表達基因, 篩選標準為FDR < 0.01,log2|(fold change)|>1。上調和下調的差異表達基因GO 富集分析采用基迪奧云平臺進行分析(https://www.omicshare.com/)。

2 結果與分析

2.1 甘藍型油菜發(fā)芽期鋅脅迫最佳濃度確定

為了確定油菜發(fā)芽期鋅脅迫的最佳處理濃度,本研究隨機挑選 10個材料, 分別利用不同濃度的Zn(NO3)2溶液和純水為對照進行處理, 發(fā)現(xiàn)處理濃度為30 mg L-1時, 這些材料下胚軸長度明顯受到抑制, 且材料間變異較大(表 1)。因此, 在發(fā)芽期篩選耐鋅油菜的最佳濃度為30 mg L-1。

2.2 甘藍型油菜鋅脅迫性狀表型變異分析

對140份油菜正常和鋅脅迫條件下的下胚軸長度進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn), 在正常條件下, 甘藍型油菜下胚軸長度為 3.66～7.99 cm, 變異系數(shù)為 15.8%; 鋅脅迫下, 下胚軸長度為 2.28～6.47 cm, 變異系數(shù)為18.8%; 相對下胚軸長的變異范圍為 0.38～1.08, 均值為 0.73, 變異系數(shù)為 17.6%, 表現(xiàn)出廣泛的表型變異(表2)。鋅脅迫下, 大部分材料的下胚軸長度都較正常生長狀態(tài)的下胚軸短, 只有5個半冬性材料例外(甘油 5號、SWU94、中油 821、川油 18和wx10213), 表明30 mg L-1鋅脅迫嚴重抑制了甘藍型油菜下胚軸伸長。相對下胚軸長呈連續(xù)性正態(tài)分布, 說明其受多基因控制, 表型為典型的數(shù)量性狀遺傳特點(圖1)。

表2 鋅脅迫下甘藍型油菜發(fā)芽期性狀統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis of the traits at germination stage under zinc stress

2.3 群體結構和親緣關系分析

利用30,288個SNP標記進行關聯(lián)群體的群體結構和親緣關系分析, 當K=2時, ΔK值最大(圖2-A),因此, 該群體的亞群數(shù)為2, 生成的最優(yōu)群體結構的Q矩陣見圖2-B。140份甘藍型材料中, 89%材料間親緣關系小于0.1 (圖2-C), 表明該群體內材料間的親緣關系較遠。

2.4 耐鋅脅迫下相對下胚軸長度的全基因組關聯(lián)分析

對相對下胚軸長度的QQ圖進行分析(圖3), 結果表明, K+Q模型檢測到的標記的P值較其他模型更接近期望值, 其降低了假陽性, 關聯(lián)分析結果更可靠。全基因組關聯(lián)分析共檢測到 8個顯著關聯(lián)的SNP位點(圖 3和表 3), 分別位于 A02、A07、C04和 C06染色體上, 單個 SNP解釋的表型變異為22.0%～33.2%。為了確定顯著關聯(lián) SNP位點的候選基因區(qū)間, 本研究對這些關聯(lián)位點的染色體進行LD分析, 利用R2值估計LD, A02和A07染色體的衰減距離為300 kb, C04染色體衰減距離為700 kb, C06染色體的衰減距離為1 Mb (圖4-A)。另外, A07染色體上22.2 Mb～23.9 Mb與C06染色體34.9 Mb～37.2 Mb位于共線性區(qū)間內(圖4-B), 說明找到的顯著關聯(lián)的SNP位點位于這2個共線性區(qū)間內。

表3 鋅脅迫下甘藍型油菜發(fā)芽期相對下胚軸長顯著關聯(lián)的SNP位點Table 3 Significant SNP locus associated with the relative hypocotyl length at germination stage under zinc stress in B. napus

2.5 鋅脅迫下油菜幼苗差異表達基因

轉錄組分析結果表明, 鋅處理油菜幼苗 7 d后,與對照相比, 上調基因 2733個, 下調基因 3652個,其中差異轉錄因子/基因 616個, 主要包括 bHLH(77)、ERF (73)、NAC (65)、MYB (60)、WRKY (55)和 C2H2 (33)家族(圖5)。ERF、NAC和WRKY家族基因上調數(shù)目較多, 而bHLH、MYB和C2H2家族基因下調基因數(shù)目較多。本研究對上調和下調基因分別進行 GO功能富集分析, 上調基因主要富集在細胞外區(qū)域和細胞膜, 分子功能是硫酸鹽跨膜轉運功能, 主要參與氧化還原反應、離子轉運、脅迫反應、防御反應和硫化合物轉運(圖6-A)。下調基因主要富集在細胞外區(qū)域、質外體和細胞膜區(qū)域, 主要的分子功能是抗氧化活性和過氧化物酶活性, 主要參與抗氧化反應、氧化還原反應和細胞壁生物合成(圖 6-B)。

2.6 GWAS與轉錄組結合鑒定共有基因

根據(jù)各染色體的 LD確定候選區(qū)間, 參照油菜基因組注釋信息[32], 共找到 19個與鋅脅迫相關的候選基因(表 4), 這些基因主要包括編碼鋅指蛋白家族成員(B-box型和 ZFP1)、谷胱甘肽轉移酶GSTU21、過氧化物酶家族蛋白、ABC和 MFS轉運蛋白及細胞壁相關激酶蛋白, 并找到一些重要的轉錄因子, 如MYB、bHLH、NAC、ERF和WRKY,大部分基因(除GSTU21、ZFP1)。

3 討論

表4 甘藍型油菜鋅脅迫下相關性狀候選基因Table 4 Candidate genes of the traits correlated with zinc stress treatment in B. napus

重金屬污染可歸納為 2類, 一類是一些具有顯著生物毒性的重金屬物, 如鎘(Cd)、砷(As)等, 另一類為超過一定量后具有生物毒性的一些重金屬, 如鋅(Zn)、銅(Cu)等[33]。近年來, 土壤重金屬污染越來越引起人們關注[34]。在土壤中過量的鋅富積會抑制植物生長, 導致營養(yǎng)失衡、萎黃葉片, 以及光合作用受損[5-6]。研究表明, 甘藍型油菜對重金屬鋅具有較強的耐受性, 在較高濃度下仍可獲得較高的生物產(chǎn)量[2-5]。然而關于油菜響應鋅脅迫的分子機制尚未見報道。在甘藍型油菜中, 通過GWAS分析與基因組信息相結合已成為挖掘油菜數(shù)量性狀基因座的常規(guī)手段, 并獲得了一些與非生物脅迫相關的候選基因[14-16,35-37]。因此, 本研究通過對鋅脅迫下140份甘藍型油菜發(fā)芽期的相對下胚軸長進行了全基因組關聯(lián)分析, 共檢測到8個顯著關聯(lián)的SNP位點, A02、C04和C06染色體上顯著關聯(lián)的SNP位點分別位于22.0、4.4和36.8 Mb, A07染色體上顯著關聯(lián)的SNP位點位于22.0 Mb和23.5 Mb。曲存民等[16]將砷脅迫下甘藍型油菜的RHL定位在A02: 19.2 Mb～22.0 Mb、A07: 19.2 Mb～22.5 Mb、A07: 23.1 Mb～23.5 Mb、C04:4.3 Mb～4.5 Mb 和 C06: 31.6 Mb～36.8 Mb, 與本研究定位結果一致, 這些位點具有一因多效性, 可能在不同重金屬脅迫過程中都起著重要作用。

在植物中, 重金屬可以引起許多代謝過程發(fā)生變化, 這些變化主要是通過氧化還原反應引起的, 同時造成抗氧化酶的活化、細胞膜通透性改變和離子的置換等反應[38]。本研究發(fā)現(xiàn)鋅脅迫后, 上調的差異表達基因主要富集在細胞膜, 參與氧化還原反應、離子轉運、防御反應和硫化合物轉運。本研究結合全基因組關聯(lián)分析和轉錄組測序, 找到 19個與鋅脅迫相關的候選基因, 包括轉錄因子/基因, 如WRKY57、ORA47和BnaA07g28000D(NAC),WRKY57可以通過清除活性氧提高植物抗旱和抗鹽能力[39-40]; 植物受到傷害和水分脅迫時,ORA47可通過調控脫落酸和茉莉酸信號途徑來提高抗性[41]。本研究中WRKY57和ORA47在鋅脅迫后顯著上調表達, 可能在鋅脅迫過程中起著重要作用, 但具體的調控機制還需進一步研究。

本研究還找到了 B-box型和鋅指蛋白 ZFP1,鋅指蛋白中的鋅指結構可以結合鋅離子形成穩(wěn)定的指狀結構, 編碼鋅指蛋白的眾多基因已經(jīng)被證明在生物和非生物脅迫過程中起著重要作用[42-43]。Sun等[44]研究表明, 菜豆 MTF通過激活色氨酸生物合成調控煙草耐鎘性, 鋅指基序是其重要的結合金屬反應的元件。擬南芥鋅指蛋白ZAT6通過谷胱甘肽途徑提高鎘抗性[45], 而鋅指蛋白 ZAT11負調控擬南芥鎳抗性[46]。本研究找到的B-box型鋅指蛋白基因BnaA02g30040D在鋅脅迫后表達量上調, 而鋅指蛋白ZFP1基因表達量下調, 它們可能通過不同的機制來響應脅迫。另外, 本研究找到 2個編碼Na+/H+逆向轉運蛋白的基因NHX6(BnaA07g35030D和BnaC06g39970D), 鋅脅迫后其表達量上調, Yang等[47]研究表明, 浮萍NHX1基因通過減少Cd2+流入和增加Cd2+外排提高重金屬鎘抗性。本研究中NHX6表達上調, 可能增加了Zn2+的外排, 從而提高鋅抗性。

重金屬處理下植物細胞產(chǎn)生活性氧造成細胞氧化損傷, 為了抵抗活性氧對細胞的損傷, 植物會產(chǎn)生抗氧化酶及非酶抗氧化劑清除自由基[48]。鋅處理下小麥過氧化氫含量、過氧化物酶及過氧化氫酶活性均顯著提高, 增強了小麥對鋅的耐受性[49]。本研究找到一些與氧化還原反應相關的基因, 如編碼過氧化物酶家族蛋白和谷胱甘肽轉移酶基因GSTU21。GST可使GSH與內源電子化合物結合而產(chǎn)生脫毒[50],重金屬(Cu和 Al)脅迫下, 擬南芥GST基因表達上調, 超表達水稻GSTU30基因提高了擬南芥重金屬耐性[51-52]。但是本研究中,GSTU21基因在鋅脅迫后表達量下調, 可能是由于鋅處理植株后, 重金屬造成的氧化脅迫反應超過了油菜自身的協(xié)調能力, 抗氧化能力受到明顯抑制。

另外, 本研究還定位到一些編碼 ABC和 MSF轉運蛋白的基因, 其功能是將重金屬轉運到液泡內,在重金屬轉運過程中起著重要作用[53-54], 這些轉運蛋白基因表達量上調, 可能通過相似的途徑增強植株對鋅的抗性。擬南芥鋁脅迫后, 可以誘導WAK1基因的表達[55];WALK4基因啟動子的突變導致水稻對鉀、鈉、銅和鋅超敏感,WALK4突變導致水稻莖中鋅含量下降[56];WAKL10基因表達量上調, 其可能在鋅脅迫過程中起著重要作用。本研究為深入研究甘藍型油菜響應鋅脅迫的分子機制奠定了基礎。

4 結論

全基因組關聯(lián)分析共鑒定出8個與鋅脅迫顯著關聯(lián)的SNP位點, 結合轉錄組測序結果, 共找到19個候選基因, 可能在鋅脅迫過程中起著重要作用。

附表1 140份甘藍型油菜材料信息Table S1 Detailed information of the 140 B. napus accessions

(續(xù)附表 1)

(續(xù)附表 1)