豬捷申病毒實(shí)驗(yàn)室診斷方法綜述

李同斌，張玉良，李錫峰

摘要：豬捷申病毒是引起豬多種癥狀甚至死亡的重要病毒性傳染病之一，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展。正確診斷豬捷申病毒病對(duì)防治該病極為關(guān)鍵。本文就該病病原分離鑒定、血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷三方面展開闡述，以期弄清該病診斷方面的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：豬捷申病毒;診斷方法;綜述

豬捷申病（porcine teschen disease）是由豬捷申病毒（porcine tescho virus，PTV）引起豬中樞神經(jīng)系統(tǒng)受侵害而導(dǎo)致一系列神經(jīng)癥狀的傳染病，以感覺過敏、震顫、麻痹、癱瘓和驚厥等為特征[1-3]。1929年在原捷克斯洛伐克捷申地區(qū)首次報(bào)道，所以又稱之為捷申病。此后歐洲、澳大利亞、北美、亞洲和非洲等均有本病的報(bào)道。2003年中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所首次分離到豬捷申病毒血清1型。到目前為止，豬捷申病已陸續(xù)在黑龍江、山東、北京、河南、云南、上海等省市檢測出，這說明豬捷申病已經(jīng)在我國蔓延開來，嚴(yán)重影響了我國的生豬生產(chǎn)，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的損失。

防治該病的關(guān)鍵措施之一是對(duì)該病病原的確診。由于當(dāng)前豬病復(fù)雜，混合感染現(xiàn)象嚴(yán)重且本病血清型眾多，因此通過傳統(tǒng)診斷方法進(jìn)行本病的確診已不現(xiàn)實(shí)，并且隨著生豬生產(chǎn)不斷向規(guī)?；?、工廠化方向發(fā)展，生豬養(yǎng)殖密度不斷提高，導(dǎo)致生豬疾病診斷準(zhǔn)確性和及時(shí)性要求不斷增加，因此豬捷申病診斷必須依靠實(shí)驗(yàn)室來診斷。自豬捷申病發(fā)現(xiàn)以來，很多專家學(xué)者對(duì)該病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行了各種方式的探索和研究，成功獲得了該病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，具體如下。

1 豬捷申病毒分離鑒定

采集樣品（發(fā)病急性期的早期采集喉拭子和腦脊髓液有利于病毒的分離;對(duì)于疑似病例，可用糞便樣品進(jìn)行病毒的分離）;將樣品用勻漿器研磨制成懸液，反復(fù)凍融、離心取上清，并用0.22μm過濾除菌;接種于豬的胚胎、腎、腸或PK-15單層細(xì)胞，培養(yǎng)3～6d，觀察細(xì)胞病變。初代培養(yǎng)病毒滴度往往較低，細(xì)胞病變不明顯或熒光信號(hào)不典型，不易判定，最好盲傳幾代再觀察病變或做熒光染色鑒定。病毒分離耗時(shí)長、步驟繁瑣、對(duì)操作人員技術(shù)要求高，僅在實(shí)驗(yàn)室使用。

2 血清學(xué)診斷

該方法主要是通過檢測捷申病毒特異性抗體，來診斷病豬是否患有豬捷申病。血清學(xué)診斷方法主要包括：病毒中和試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。

病毒中和試驗(yàn)：先將血清56℃滅活30min;用細(xì)胞培養(yǎng)液倍比稀釋血清，添加100TCID50/孔病毒，37℃孵育1h;繼續(xù)添加豬腎細(xì)胞懸液，置37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);計(jì)算血清中和效價(jià)。

間接免疫熒光試驗(yàn)：王瑤等[4]首先構(gòu)建PTV VP1表達(dá)系統(tǒng)，然后利用該系統(tǒng)建立了檢測PTV血清抗體的間接免疫熒光方法;利用該方法對(duì)哈爾濱周邊地區(qū)的575份豬血清樣品進(jìn)行檢測，PTV感染的陽性率為60.17%。2011年，劉芹防等[5]用全病毒（PTV-8 Jilin/2003株）制備抗原板，以鼠抗豬IgG熒光標(biāo)記抗體為二抗，建立了檢測PTV抗體的間接免疫熒光技術(shù)方法，該方法與病毒中和試驗(yàn)方法符合率為94.0%，用該方法檢測1，500份臨床血清樣品，平均陽性率為55.8%。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：胡峰等[6]以原核表達(dá)純化的PTV VP1重組蛋白為包被原，建立起豬捷申病毒抗體的間接ELISA檢測方法;并運(yùn)用ELISA檢測方法對(duì)633份臨床樣品進(jìn)行檢測，陽性率是88.10%;選取58份臨床樣品與間接免疫熒光方法作比對(duì)試驗(yàn)，兩者的符合率是94.80%。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)相對(duì)來說比較容易操作，并且對(duì)于試驗(yàn)條件和人員的要求都不高，一次能夠檢測大批量的樣本，非常適合養(yǎng)殖場診斷疫病和縣級(jí)及以下的實(shí)驗(yàn)室做流行病學(xué)調(diào)查。

3 分子生物學(xué)檢測

豬捷申病毒分子生物學(xué)檢測方法是基于檢測PTV病毒核酸序列發(fā)展起來的，豬捷申病毒分子生物學(xué)檢測方法主要包括RT-PCR以及熒光定量RT-PCR兩種方法。豬捷申病毒分子生物學(xué)檢測方法是診斷豬捷申病最為準(zhǔn)確、速度最快還可以一次對(duì)大批量樣本進(jìn)行檢測的方法，并且該檢測技術(shù)在檢測豬是否感染豬捷申病毒的同時(shí)還能檢測豬瘟、藍(lán)耳病和圓環(huán)病毒，不受其他病毒的干擾，一次檢測3～4h就可以全部完成。

RT-PCR，其主要利用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。就是在RT-PCR中，首先將一條RNA鏈逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)的DNA，然后以此DNA為模板，利用PCR進(jìn)行DNA的擴(kuò)增。趙國洪等[7]根據(jù)Gen Bank收錄的PTV基因序列設(shè)計(jì)套式引物，建立了檢測PTV的套式RT-PCR診斷方法，應(yīng)用該方法能夠從云南省某豬場疑似豬捷申病的病料中檢測出PTV核酸陽性;張曉杰等[8]根據(jù)Gen Bank登錄有關(guān)的豬捷申病毒基因序列，并選擇保守區(qū)域進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，應(yīng)用該方法對(duì)43份臨床樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，PTV陽性率為23%。

熒光定量RT-PCR檢測法，是通過運(yùn)用PCR擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測，通過這種方法來實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。該檢測方法廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、基因?qū)W以及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。王建峰等[9]通過設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立起豬捷申病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，用該方法檢測來自豬場的156份豬糞便樣品，陽性檢出率為38.5%，與套式RT-PCR符合率達(dá)100%;胡峰等[10]于2012年建立了檢測PTV的TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法（基于PTV基因組5'端非編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針），應(yīng)用該方法和病毒分離方法分別檢測了91份臨床樣品，檢出率分別為79.12%和57.14%，兩者的符合率是78.02%;楊濤濤等[11]2019年建立一種檢測豬捷申病毒（PTV）的SYBR Green Ⅰ熒光定量RT-PCR方法，該方法特異性強(qiáng)（對(duì)除PTV外的其他常見豬病毒性病原的DNA或cDNA均無特異性的擴(kuò)增），該方法的敏感性高、重復(fù)性好，靈敏度能達(dá)到38.3copies/μL（對(duì)臨床樣品的檢測熒光定量RT-PCR方法的PTV檢出率為68.18%，遠(yuǎn)高于普通RT-PCR的PTV檢出率（22.73%））;秦毅斌等[12]于2020年建立豬捷申病毒（PTV）的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（RT-qPCR）檢測方法，該方法僅對(duì)PTV出現(xiàn)特異性擴(kuò)增反應(yīng)，與豬流行性腹瀉病毒、豬丁型冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、A群豬輪狀病毒等常見豬病毒均無交叉反應(yīng)，應(yīng)用所建立的方法對(duì)235份臨床豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測，PTV陽性樣品32份，樣品陽性率為13.62%。

4 展望

目前在我國對(duì)豬捷申病毒研究較少，尤其是在疫苗方面，至今還未研制。我國是世界上生豬養(yǎng)殖第一大國，豬肉是全國人民最主要的肉食來源，是主要蛋白質(zhì)的提供者。2018年我國因暴發(fā)非洲豬瘟，導(dǎo)致生豬存欄量驟降，豬肉價(jià)格創(chuàng)國內(nèi)歷史新高，嚴(yán)重影響普通群眾的生活。經(jīng)過近3年的恢復(fù)，生豬存欄才恢復(fù)到非洲豬瘟暴發(fā)前的90%以上。因此，為了保證我國人民群眾的食品安全，我國畜牧獸醫(yī)等相關(guān)部門，必須要做到未雨綢繆，加大對(duì)豬捷申病毒的研究力度，盡快研制出相關(guān)疫苗，防止豬捷申病在我國出現(xiàn)大范圍流行。

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