草地貪夜蛾幼蟲對常用殺蟲劑相對敏感基線的建立

王歡歡, 呂圣蘭, 趙 瑞, 梁 沛, 張 帥,高希武, 張 雷,*, 谷少華,*

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系, 北京100193; 2. 全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心, 北京 100026)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda，又稱秋黏蟲，屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾屬Spodoptera，原分布于美洲，最早記載于1797年，1856年報(bào)道為害棉花，1917年報(bào)道了其防治方法(Murúaetal., 2009; 李永平等, 2019)。該蟲以多食性著稱，具有很強(qiáng)的遷移和擴(kuò)散能力，對玉米、小麥、水稻、高粱、甘蔗及棉花等多種作物造成嚴(yán)重為害(Casmuzetal., 2015)。2018年12月草地貪夜蛾從緬甸入境入侵我國云南省并迅速擴(kuò)散，現(xiàn)已成為我國主要的入侵害蟲之一(Sunetal., 2021)。

2000年之前，美洲地區(qū)對草地貪夜蛾以化學(xué)防治為主(Gutiérrez-Morenoetal., 2019)。由于抗藥性問題，當(dāng)?shù)赜?000年開始種植Bt抗蟲玉米(表達(dá)Cry1F)，但自2007年起陸續(xù)在多個(gè)國家發(fā)現(xiàn)該蟲對Cry1F產(chǎn)生抗性并導(dǎo)致Bt抗蟲玉米防效下降(Storeretal., 2010; Xiao, 2021)，因此南美洲大部分地區(qū)又重新使用殺蟲劑進(jìn)行防控。目前草地貪夜蛾已對41種殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性，產(chǎn)生抗性的殺蟲劑既包括有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類等傳統(tǒng)殺蟲劑，也包括雙酰胺類、多殺菌素等新型殺蟲劑(APRD, 2019; Sparksetal., 2020)。入侵我國的草地貪夜蛾已經(jīng)攜帶有高頻率的對有機(jī)磷類和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性基因(李妍等, 2020; Zhangetal., 2020)。

由于我國尚未推廣種植轉(zhuǎn)基因玉米，目前對草地貪夜蛾防治主要依靠化學(xué)殺蟲劑。但由于我國地域廣闊，草地貪夜蛾在不同地區(qū)的發(fā)生情況不同，因此不同地區(qū)的用藥品種、強(qiáng)度和頻次也都存在差異，導(dǎo)致不同地區(qū)草地貪夜蛾種群對殺蟲劑的抗性發(fā)展也不一致。因此，加強(qiáng)不同地區(qū)草地貪夜蛾抗藥性水平監(jiān)測，對于指導(dǎo)合理用藥、有效治理草地貪夜蛾具有重要意義。而進(jìn)行抗藥性監(jiān)測的前提就是建立靶標(biāo)害蟲對不同藥劑的敏感基線(吳益東等, 2001)。雖然國外已經(jīng)有草地貪夜蛾對殺蟲劑敏感基線的相關(guān)報(bào)道(Yu, 1991; Yuetal., 2003; Gutiérrez-Morenoetal., 2019)，但這些敏感基線都是用室內(nèi)絕對敏感種群建立，其敏感基線數(shù)據(jù)不宜用于我國草地貪夜蛾抗性監(jiān)測和指導(dǎo)用藥。

而國內(nèi)目前尚無草地貪夜蛾對常用殺蟲劑敏感基線的報(bào)道，因此迫切需要在草地貪夜蛾入侵我國初期、尚未產(chǎn)生明顯抗藥性之前建立可靠的敏感基線并進(jìn)行抗性監(jiān)測，以便準(zhǔn)確掌握草地貪夜蛾田間種群的抗藥性水平及發(fā)展動(dòng)態(tài)，及時(shí)調(diào)整用藥策略，在有效防治草地貪夜蛾的同時(shí)延緩其抗藥性發(fā)展。鑒于不同研究人員進(jìn)行草地貪夜蛾抗藥性監(jiān)測時(shí)所采用的生物測定方法不同，本研究分別采用點(diǎn)滴法、浸葉法和飼料藥膜法3種常用生測方法建立了草地貪夜蛾對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(甲維鹽)等6大類共7種常用殺蟲劑的相對敏感基線，為草地貪夜蛾的抗藥性監(jiān)測及其抗藥性治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

根據(jù)2019年中國草地貪夜蛾對殺蟲劑的抗性監(jiān)測結(jié)果(未發(fā)表數(shù)據(jù))，選擇其中最敏感的云南種群用于建立對甲維鹽、乙基多殺菌素和四氯蟲酰胺的敏感基線，海南種群用于建立對蟲螨腈、虱螨脲和茚蟲威的敏感基線，湖北種群用于建立對氯蟲苯甲酰胺的敏感基線。3個(gè)種群均是2019年6月份采自當(dāng)?shù)赜衩滋铩Ｋ蟹N群均在室內(nèi)26±1℃、相對濕度70%±5%、光暗周期16L∶8D條件下用人工飼料飼養(yǎng)5～7代，期間不接觸任何殺蟲劑。

1.2 供試藥劑及試劑

95%四氯蟲酰胺(沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司)，99%乙基多殺菌素(陶氏益農(nóng)中國有限公司)，92%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(河北沃德豐藥業(yè)有限公司)，96%蟲螨腈(江蘇維尤納特精細(xì)化工有限公司)，96%虱螨脲(瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)，90%茚蟲威(京博農(nóng)化科技有限公司)，95%氯蟲苯甲酰胺(蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)、丙酮均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，Triton X-100(美國Amresco公司)。

1.3 毒力測定

1.3.1浸葉法：參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 1154.14-2008農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺蟲劑第14部分：浸葉法》進(jìn)行生物測定，略有改動(dòng)。具體步驟為：將原藥配制成母液，除氯蟲苯甲酰胺用二甲基亞砜溶解外，其余原藥均用丙酮溶解。然后用0.1% Triton X-100水溶液將母液按等比稀釋成5～7個(gè)系列濃度，將喇叭口期的非轉(zhuǎn)基因新鮮玉米葉片剪成長×寬=1 cm×1 cm的葉段。分別將葉段在不同濃度的藥液中浸泡20 s后，放在濾紙上陰干后置于12孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板每孔預(yù)先倒入1.5%瓊脂1 mL保濕。每孔6個(gè)葉段，并接入1頭3齡第2天幼蟲。每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)不少于12頭幼蟲。以0.1% Triton X-100水溶液處理為對照。根據(jù)不同藥劑作用特點(diǎn)，雙酰胺類藥劑以及虱螨脲在處理后96 h檢查結(jié)果，其余藥劑均在處理后48 h檢查結(jié)果。用毛筆輕觸幼蟲無反應(yīng)則視為死亡。

1.3.2點(diǎn)滴法：參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 1154.1-2006農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺蟲劑第1部分：點(diǎn)滴法》進(jìn)行生物測定，略有改動(dòng)。具體步驟為：將原藥配制成母液，除氯蟲苯甲酰胺用二甲基亞砜溶解外，其余原藥均用丙酮溶解。將配制好的母液再按等比稀釋成5～7個(gè)系列濃度，用微量點(diǎn)滴器(Hamilton PB600-1)逐個(gè)點(diǎn)滴于3齡第2天幼蟲(平均體重約0.005 g)的前胸背板上，每頭點(diǎn)滴0.2 μL，將點(diǎn)滴后的試蟲轉(zhuǎn)入直徑9 cm培養(yǎng)皿中，放入足量人工飼料正常飼養(yǎng)。每處理重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)10頭幼蟲，以相應(yīng)溶劑點(diǎn)滴處理為對照。在處理后24 h檢查結(jié)果，用毛筆輕觸幼蟲無反應(yīng)或有明顯的中毒癥狀(畸形、顫搐、停止取食等)則視為死亡。由于虱螨脲以胃毒作用為主，觸殺作用差，所以本方法中未測定虱螨脲的毒力。

1.3.3飼料藥膜法：參考Bolzan等(2019)的方法有改進(jìn)。具體步驟為：將原藥配制成母液，除氯蟲苯甲酰胺用二甲基亞砜溶解外，其余原藥均用丙酮溶解。將配制好的母液用0.1% Triton X-100水溶液等比稀釋成5～7個(gè)系列梯度。在24孔培養(yǎng)板中，每孔分別加入冷卻至60℃左右的液態(tài)人工飼料1 mL并放涼使其自然固化。然后每孔滴入50 μL不同濃度藥液并均勻涂布于飼料表面，置于室溫下晾干后每孔接入1頭2齡幼蟲。每處理重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)12頭幼蟲，以0.1% Triton X-100水溶液處理為對照。除虱螨脲在處理后96 h檢查結(jié)果外，其余藥劑均在處理后48 h檢查結(jié)果，結(jié)果檢查方法同1.3.2節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用POLO軟件(LeOra Software Inc., California, 美國)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對照死亡率小于10%為有效測定，并用對照死亡率進(jìn)行校正，求出毒力回歸線Slope值及其標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)、致死中濃度(LC50)或致死中劑量(LD50)值及其95%置信限、卡方值(χ2)、自由度(df)以及P值。

2 結(jié)果

2.1 浸葉法測定的草地貪夜蛾3齡幼蟲對7種殺蟲劑的相對敏感基線

浸葉法測定結(jié)果表明，草地貪夜蛾3齡幼蟲對甲維鹽最敏感，LC50值為0.054 mg/L；對虱螨脲、四氯蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、乙基多殺菌素和蟲螨腈等5種殺蟲劑敏感性較高，LC50值均小于2 mg/L；對茚蟲威敏感性中等，LC50值為12.131 mg/L。草地貪夜蛾對不同藥劑的敏感性由高到低依次為甲維鹽、虱螨脲、四氯蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、乙基多殺菌素、蟲螨腈和茚蟲威(表1)。

2.2 點(diǎn)滴法測定的草地貪夜蛾3齡幼蟲對6種殺蟲劑的相對敏感基線

點(diǎn)滴法測定結(jié)果表明，各藥劑對草地貪夜蛾3齡幼蟲的LD50值均在5 μg/g以下，其中對甲維鹽最敏感，LD50值為0.355 μg/g，對氯蟲苯甲酰胺和乙基多殺菌素次之，LD50值分別為0.410和0.518 μg/g。四氯蟲酰胺、蟲螨腈和茚蟲威對草地貪夜蛾LD50值分別為1.244, 2.097和4.707 μg/g。草地貪夜蛾對不同藥劑的敏感性由高到低依次為甲維鹽、氯蟲苯甲酰胺、乙基多殺菌素、四氯蟲酰胺、蟲螨腈和茚蟲威(表2)。

2.3 飼料藥膜法測定的草地貪夜蛾2齡幼蟲對7種殺蟲劑的相對敏感基線

飼料藥膜法測定結(jié)果表明，草地貪夜蛾2齡幼蟲對不同殺蟲劑的敏感性差異較小，LC50值均在0.3 μg/cm2以下，其中對甲維鹽最敏感，LC50值為0.003 μg/cm2。草地貪夜蛾對不同藥劑的敏感性由高到低依次為甲維鹽、虱螨脲、乙基多殺菌素、氯蟲苯甲酰胺、四氯蟲酰胺、蟲螨腈和茚蟲威(表3)。

表1 草地貪夜蛾3齡幼蟲對7種殺蟲劑的相對敏感基線(浸葉法)Table 1 Relative susceptible baselines of the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperdato seven insecticides (leaf-dip method)

表2 草地貪夜蛾3齡幼蟲對6種殺蟲劑的相對敏感基線(點(diǎn)滴法)Table 2 Relative susceptible baselines of the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperdato six insecticides (topical application)

表3 草地貪夜蛾2齡幼蟲對7種殺蟲劑的相對敏感基線(飼料藥膜法)Table 3 Relative susceptible baselines of the 2nd instar larvae of Spodoptera frugiperdato seven insecticides (diet surface overlay bioassay)

3 討論

目前農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的多數(shù)防治草地貪夜蛾的藥劑都兼具胃毒和觸殺作用。不同生物測定方法所測得的害蟲對殺蟲劑的敏感性結(jié)果往往不同。點(diǎn)滴法主要測定殺蟲劑的觸殺作用，定量準(zhǔn)確，是目前最為精準(zhǔn)的測定方法；浸葉法與田間莖葉噴霧處理的效果最為接近，能夠同時(shí)反映藥劑的觸殺和胃毒毒力；飼料藥膜法測定的也是殺蟲劑觸殺和胃毒的聯(lián)合作用。因此，這3種方法都能反映目前生產(chǎn)上主推藥劑對草地貪夜蛾的毒力，因而在殺蟲劑活性評價(jià)和抗性監(jiān)測中被廣泛使用。本研究以室內(nèi)建立的云南、海南和湖北3個(gè)草地貪夜蛾相對敏感種群為材料，分別采用點(diǎn)滴法、浸葉法和飼料藥膜法3種不同的生測方法建立了草地貪夜蛾對常用殺蟲藥劑的敏感基線，為建立完善的草地貪夜蛾抗藥性監(jiān)測體系，盡早開展抗藥性監(jiān)測工作提供支持。雖然本研究所用的云南、海南和湖北種群都是不接觸殺蟲劑的情況下連續(xù)飼養(yǎng)多代的相對敏感種群，但3個(gè)種群對不同藥劑的敏感性還是存在一定差異。因此，我們在測定3個(gè)種群對7種常用殺蟲劑敏感性的基礎(chǔ)上，分別選擇中國最敏感的種群建立相應(yīng)敏感基線，如選擇云南種群建立對甲維鹽、乙基多殺菌素和四氯蟲酰胺的敏感基線，選擇海南種群建立對蟲螨腈、虱螨脲和茚蟲威的敏感基線，選擇湖北種群建立對氯蟲苯甲酰胺的敏感基線，以期為田間草地貪夜蛾的抗性監(jiān)測提供最接近實(shí)際情形的敏感基線。

高祖鵬等(2020)以飼料藥膜法測得氯蟲苯甲酰胺對草地貪夜蛾的LC50值為4.52 mg/L，是本研究結(jié)果(表3)的4倍。魯艷輝等(2020)以浸葉法測得氯蟲苯甲酰胺對草地貪夜蛾的LC50值為4.483 mg/L，顯著高于本研究中浸葉法測定的結(jié)果(表1)。上述差異主要是因?yàn)楸狙芯克孟鄬γ舾衅废翟谑覂?nèi)不接觸殺蟲劑的情況下連續(xù)飼養(yǎng)了至少5～7代，而其他研究中所用草地貪夜蛾基本都是直接采自田間的種群，并非相對敏感種群。但這些結(jié)果也反映出我國的草地貪夜蛾田間種群已經(jīng)對常用藥劑產(chǎn)生了不同水平的抗性，更加凸顯了盡快建立敏感基線、對草地貪夜蛾抗藥性進(jìn)行系統(tǒng)監(jiān)測的緊迫性。而Lira等(2020)以浸葉法測得乙基多殺菌素對巴西草地貪夜蛾敏感品系的LC50值為0.63 mg/L，與本研究結(jié)果(表1)基本一致，說明本研究中建立敏感基線所選擇的草地貪夜蛾品系是合適的。

由于草地貪夜蛾具有遷飛性和暴發(fā)性特點(diǎn)，化學(xué)殺蟲劑將持續(xù)在其防治中扮演主要角色。而入侵我國的草地貪夜蛾種群本身已經(jīng)攜帶高頻率的抗性基因(李妍等, 2020)，加之目前以應(yīng)急防控為核心的少數(shù)幾種殺蟲劑的大量、持續(xù)使用，必將加速草地貪夜蛾的抗藥性發(fā)展。而且我國不同地區(qū)(如周年繁殖區(qū)、遷飛過渡區(qū)和重點(diǎn)防范區(qū))因草地貪夜蛾發(fā)生情況不同，用藥種類和頻率也各不相同，因此其產(chǎn)生抗藥性的速度和水平也會(huì)不同。系統(tǒng)監(jiān)測我國不同地區(qū)草地貪夜蛾的抗藥性對于因地制宜制訂抗性治理策略就顯得尤為重要(李永平等, 2019; 吳益東等, 2019)。害蟲對殺蟲劑的敏感基線是評價(jià)其抗藥性水平的重要依據(jù)，在抗藥性監(jiān)測以及治理中具有重要意義。如棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(陳長琨等, 2000)、麥長管蚜Sitobionavenae(魯艷輝等, 2009)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(李秀環(huán)等, 2012)及稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis(王世玉等, 2016)等重要害蟲對殺蟲劑敏感基線的建立，使得對這些害蟲抗藥性的長期監(jiān)測和科學(xué)防控成為可能。與其他害蟲一樣，草地貪夜蛾理論上可以對任何用于其防治的殺蟲劑產(chǎn)生抗性。Zhang等(2021)對云南等4個(gè)省份的5個(gè)草地貪夜蛾種群抗藥性測定發(fā)現(xiàn)，除雙酰胺類外，所有種群都對有機(jī)磷類、噁二嗪和擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生了高水平抗性。但由于缺乏敏感基線，對草地貪夜蛾的抗藥性監(jiān)測無法正常進(jìn)行。因此，本文建立了草地貪夜蛾對常用殺蟲劑的敏感基線，對于系統(tǒng)監(jiān)測其抗藥性、指導(dǎo)合理用藥以及評價(jià)抗藥性治理措施的有效性都具有重要意義。