低溫對(duì)麥紅吸漿蟲滯育解除及蛻皮激素受體基因EcR和熱激蛋白基因Hsp70和Hsp90表達(dá)水平的影響

張國(guó)軍, 王 穩(wěn), 南江磊, 成衛(wèi)寧,*, 朱克巖

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 陜西楊凌 712100; 2. Department of Entomology, Texas A&M University, Texas 77843, USA)

滯育是由昆蟲遺傳決定的對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，也是昆蟲生活史保持與季節(jié)同步的一種手段(Denlinger, 2002)。昆蟲一旦進(jìn)入滯育，恢復(fù)發(fā)育需要一定的時(shí)間，時(shí)間長(zhǎng)度與滯育期經(jīng)歷的環(huán)境條件有關(guān)。典型的滯育進(jìn)程包括滯育啟動(dòng)、維持、終止、滯育后靜息及發(fā)育等一系列動(dòng)態(tài)的連續(xù)階段(Ko?tál, 2006)，每個(gè)階段均受一個(gè)或多個(gè)因子的影響。研究發(fā)現(xiàn)，低溫是大多數(shù)滯育昆蟲滯育解除最常見和主要的因子(Sgolastraetal., 2010; Dongetal., 2013; Denlinger and Armbruster, 2014; Togashi, 2019)；光周期在一些昆蟲滯育解除中也起一定作用(Ko?tál and Hodek, 1997; Xiaoetal., 2006; Wangetal., 2009)。研究環(huán)境因子對(duì)昆蟲滯育解除的影響對(duì)深入理解滯育生物學(xué)以及對(duì)滯育昆蟲室內(nèi)飼養(yǎng)也具有重要意義。

昆蟲滯育不僅受環(huán)境影響，更重要的是受激素調(diào)節(jié)(Emersonetal., 2009; Chengetal., 2020)。蛻皮激素受體(ecdysone receptor, EcR)是蛻皮激素20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)的作用靶標(biāo)，是昆蟲體內(nèi)重要的調(diào)控蛋白。研究表明，20E在昆蟲滯育解除的調(diào)控中具有重要作用，作為其受體的EcR可能也在滯育解除中發(fā)揮重要作用(Fujiwaraetal., 1995; Rinehartetal., 2001; Denlinger, 2002)。熱激蛋白(heat shock protein, HSP)是機(jī)體遭受熱、冷和其他許多不利因素脅迫時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類高度保守的蛋白質(zhì)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，HSP基因的表達(dá)與環(huán)境脅迫和昆蟲滯育發(fā)育密切相關(guān)，如苜蓿切葉蜂Megachilerotundata和麻蠅Sarcophagacrassipalpis的Hsp70和Hsp90(Haywardetal., 2005; Yocumetal., 2005)。

麥紅吸漿蟲Sitodiplosismosellana是世界小麥生產(chǎn)中最重要的害蟲之一，同時(shí)也是典型的專性幼蟲期滯育昆蟲，主要以老熟幼蟲在土壤中結(jié)繭滯育，滯育過(guò)程中經(jīng)歷夏、秋、冬季，3-4月土壤濕度較高時(shí)，幼蟲破繭恢復(fù)活動(dòng)，隨后化蛹、羽化(王越等, 2015)，故破繭率和破繭速率通常被視作滯育終止的直接指標(biāo)，但在實(shí)驗(yàn)條件下破繭的幼蟲能否完成發(fā)育，即破繭能否準(zhǔn)確反映低溫滯育終止情況尚不清楚。前期我們以成蟲羽化率和羽化速率為指標(biāo)，探討了低溫在麥紅吸漿蟲滯育終止中的作用(Chengetal., 2017)，并研究了EcR,Hsp70和Hsp90在自然滯育進(jìn)程中的表達(dá)動(dòng)態(tài)(Chengetal., 2016; 劉禹含, 2019)。為明確麥紅吸漿蟲各滯育終止指標(biāo)的關(guān)系，闡明低溫滯育終止的分子機(jī)理，在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究測(cè)定分析了低溫(4℃)對(duì)麥紅吸漿蟲滯育幼蟲破繭率、破繭速率、化蛹率和化蛹速率的影響及低溫終止滯育進(jìn)程中EcR,Hsp70和Hsp90的表達(dá)水平變化，研究結(jié)果不僅有助于人們理解麥紅吸漿蟲的滯育解除機(jī)制，同時(shí)為人工飼養(yǎng)該蟲、開展更為系統(tǒng)深入的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2018年5月小麥黃熟期，從當(dāng)年麥紅吸漿蟲重發(fā)地陜西興平麥田(34°24′N, 108°46′E)大量采集感蟲麥穗，放入位于陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)校園的室外養(yǎng)蟲圃(34°16′N, 108°40′E)，讓老熟幼蟲自然落土，結(jié)繭進(jìn)入滯育。以同年9月上旬采集的結(jié)繭幼蟲作為低溫處理供試蟲源，9-12月采集的結(jié)繭幼蟲作為自然變溫處理蟲源。養(yǎng)蟲圃夏季播種玉米，秋季播種小麥。

1.2 低溫(4℃)處理的麥紅吸漿蟲滯育解除觀測(cè)

9月1日從養(yǎng)蟲圃采集含結(jié)繭幼蟲的土壤，置于海爾冷柜(BC/BD-320 HK)進(jìn)行4℃低溫處理，分別在處理0(對(duì)照), 30, 45, 60, 75和90 d后取出部分土壤，采用淘土法(仵均祥等, 2005)收集結(jié)繭幼蟲，每次收集150頭，分為3組(即3個(gè)重復(fù))，每組50頭，單頭放入含有1%瓊脂糖且標(biāo)有A1-A50, B1-B50和C1-C50的離心管中，蓋好管蓋(扎有小孔)后置于24±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期16L∶8D的人工氣候箱(BIC-300型，上海博訊)，每天觀察3次并記錄幼蟲的破繭數(shù)，幼蟲破繭恢復(fù)發(fā)育后記錄化蛹數(shù)。試驗(yàn)結(jié)束后(一周內(nèi)無(wú)幼蟲破繭或化蛹)計(jì)算不同低溫處理時(shí)長(zhǎng)下幼蟲的破繭率、存活個(gè)體的化蛹率以及破繭(移入氣候箱至離開繭)和化蛹(破繭至前蛹形成)所需時(shí)間。

1.3 自然變溫處理的麥紅吸漿蟲滯育解除觀測(cè)

9月1日開始，每月從養(yǎng)蟲圃采集土壤，共6次，即0, 30, 45, 60, 75和90 d后各采集1次，淘土收集結(jié)繭幼蟲，每次收集150頭，分為3組，每組50頭，隨后的處理、觀察及計(jì)算內(nèi)容同1.2節(jié)。2018年9, 10, 11和12月楊凌平均氣溫分別為19.42, 13.31, 6.82和0.68℃，數(shù)據(jù)來(lái)自楊凌示范區(qū)氣象局。

1.4 滯育解除及滯育后發(fā)育進(jìn)程中麥紅吸漿蟲ECR, Hsp70和Hsp90基因表達(dá)水平測(cè)定

對(duì)1.2節(jié)4℃處理0-90 d的幼蟲，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)再至少收集80頭，每20頭裝于2 mL凍存管，液氮速凍后-80℃保存。另外，處理90 d后的幼蟲，再多收集300頭，放于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿，置于24±1℃下讓其發(fā)育，收集恢復(fù)發(fā)育3, 5和7 d的活動(dòng)幼蟲，每20頭裝于2 mL凍存管，液氮速凍后-80℃保存。分別取各時(shí)期收集的幼蟲20頭，按照RNAiso Plus總RNA提取試劑盒(TaKaRa, 大連)說(shuō)明書提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano-300型核酸測(cè)定儀(杭州奧盛儀器有限公司)檢測(cè)后，以1 μg的量為模板，參照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa, 大連)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA第1鏈，-20℃保存；各時(shí)期重復(fù)3次。

根據(jù)麥紅吸漿蟲EcR(GenBank登錄號(hào): MN853890)、Hsp70(GenBank登錄號(hào): KJ813013)、Hsp90(GenBank登錄號(hào): KJ813012)和內(nèi)參基因GAPDH(GenBank登錄號(hào): KR733066)序列設(shè)計(jì)引物(表1)。以不同處理試蟲的cDNA為模板，參照SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒說(shuō)明書(TaKaRa, 大連)，在QuanStudio?5實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific, MA)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20 μL): Premix Ex TaqTMII 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA模板1 μL, 其余為RNase-free H2O。 擴(kuò)增條件： 95℃預(yù)變性30 s； 95℃變性10 s， 60℃退火1 min， 72℃延伸30 s， 共40個(gè)循環(huán)。每樣品重復(fù)測(cè)定3次。以未經(jīng)低溫處理的幼蟲為基準(zhǔn)，采用2-ΔΔCT法(Livak and Schmittgen, 2001)計(jì)算各處理目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件(Chicago, IL., 美國(guó))進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。各處理幼蟲的破繭率和化蛹率平方根反正弦轉(zhuǎn)換后數(shù)據(jù)、發(fā)育歷期及基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)，Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 低溫(4℃)與自然變溫對(duì)滯育幼蟲破繭率的影響

低溫處理不同時(shí)間的麥紅吸漿蟲結(jié)繭幼蟲(9月上旬)轉(zhuǎn)移至24℃，破繭率存在顯著差異(P<0.05)。其中，在0-60 d，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，破繭率逐漸升高，未經(jīng)低溫處理的幼蟲(對(duì)照)破繭率為71.3%，處理45 d的破繭率增長(zhǎng)為92%，顯著高于對(duì)照(P<0.05)，60 d的達(dá)到95.3%；60-90 d的破繭率穩(wěn)定在95.3%～97.3%(圖1: A)。

自然低溫處理不同時(shí)間的結(jié)繭幼蟲，破繭率也存在顯著差異(P<0.05)，且變化趨勢(shì)與4℃低溫相似，即隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，破繭率隨之升高，處理45 d的(10月15日)達(dá)到88.7%，60 d的高達(dá)94.0%；60-90 d的破繭率穩(wěn)定在93.3%～95.3%之間(圖1: B)。

圖1 4℃低溫(A)和自然變溫(B)處理不同時(shí)間后的麥紅吸漿蟲滯育幼蟲在24℃的破繭率Fig. 1 Cocoon breaking rate of the Sitodiplosis mosellana diapausing larvae after exposed to low temperature (4℃) (A)and natural temperature (B) for different time prior to pupation at 24℃圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示不同處理時(shí)間間差異顯著(P<0.05, Duncan氏新復(fù)極差法)。Data in the figure are mean±SE, and different letters above bars show significant difference among different treatment time (P<0.05, Duncan’s multiple range test). 下圖同The same for the following figures.

2.2 低溫(4℃)與自然變溫對(duì)滯育幼蟲破繭前期的影響

低溫(4℃)處理時(shí)間顯著影響結(jié)繭幼蟲破繭所需時(shí)間(P<0.05)。未經(jīng)低溫處理的幼蟲(對(duì)照) 1 d內(nèi)僅1頭破繭，最長(zhǎng)的破繭需要29.5 d，平均8.1 d；隨著低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)，破繭速率明顯加快。低溫處理30 d的幼蟲，1 d內(nèi)8頭破繭，最長(zhǎng)的破繭需要26.5 d，平均6.2 d，顯著低于對(duì)照；低溫處理45-90 d，平均破繭僅需3.6～4.0 d，處理間無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖2: A, B)。

自然變溫處理也明顯加快結(jié)繭幼蟲的破繭速率，處理30 d后，平均破繭需要5.5 d，顯著低于未處理的對(duì)照(P<0.05)；處理60～90 d后，約需3.6 d，與4℃低溫處理效果相似(圖2: C, D)。

圖2 4℃低溫(A和B)和自然變溫(C和D)處理不同時(shí)間后的麥紅吸漿蟲滯育幼蟲在24℃破繭所需時(shí)間和累計(jì)破繭率Fig. 2 Time required for cocoon breaking and cumulative cocoon breaking rates of Sitodiplosis mosellana diapausing larvae afterexposed to low temperature (4℃) (A and B) and natural temperature (C and D) for different time prior to pupation at 24℃

圖3 4℃低溫(A)和自然變溫(B)處理不同時(shí)間后的麥紅吸結(jié)繭幼蟲在24℃下的化蛹率Fig. 3 Pupation rates of Sitodiplosis mosellana cocooned larvae after exposed to low temperature (4℃) (A)and natural temperature (B) for different time prior to pupation at 24℃

2.3 低溫(4℃)與自然變溫對(duì)滯育幼蟲化蛹率的影響

未經(jīng)低溫(4℃)處理的結(jié)繭幼蟲，轉(zhuǎn)移至24℃后，沒有1頭化蛹。4℃低溫處理明顯促進(jìn)滯育幼蟲化蛹，處理0-60 d，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)化蛹率顯著提高，30 d處理的化蛹率為14.7%，60 d處理的增加到91.0%(P<0.05)。處理60-90 d，化蛹率維持在91.0%～97.3%，處理間差異不顯著(P>0.05)(圖3: A)。

自然變溫處理時(shí)間也顯著影響滯育幼蟲化蛹，但與4℃低溫處理比較，自然變溫處理30-60 d(即9月上旬到11月上旬)增加幅度較小，處理30 d(10月上旬)的化蛹率僅為9.6%，處理45 d和60 d的分別為13.5%和28.0%，處理75 d的增幅較大，為62.8%，處理90 d的顯著增加到92.7%(P<0.05)(圖3: B)，與4℃低溫處理的效果相當(dāng)。

2.4 低溫(4℃)與自然變溫處理對(duì)化蛹前期的影響

4℃低溫(圖4: A, B)和自然變溫(圖4: C, D)處理不同時(shí)間的幼蟲，化蛹所需時(shí)間存在顯著差異(P<0.05)，總體趨勢(shì)是處理時(shí)間越長(zhǎng)，化蛹速率越快，平均所需時(shí)間越短；低溫和自然變溫處理30 d的幼蟲，平均化蛹所需時(shí)間分別為18.7 d和18.0 d；但當(dāng)處理時(shí)間≥45 d后，處理間化蛹所需時(shí)間差異不顯著(P>0.05)，低溫和自然變溫處理化蛹所需時(shí)間分別為14.1～15.3 d和13.0～15.4 d。

2.5 麥紅吸漿蟲EcR, Hsp70和Hsp90在低溫(4℃)終止滯育及滯育后發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)水平變化

EcR,Hsp70和Hsp90在低溫(4℃)終止滯育及24℃下滯育后發(fā)育不同時(shí)間的麥紅吸漿蟲幼蟲中的表達(dá)水平分析結(jié)果表明，3個(gè)基因在滯育發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，且表達(dá)模式相似，即低溫處理可刺激滯育幼蟲3個(gè)基因的表達(dá)，其中30 d處理的表達(dá)量最高，EcR,Hsp70和Hsp90表達(dá)量分別為對(duì)照的3.55, 4.58和3.74倍；之后隨著低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸下降，其中EcR和Hsp90在處理60 d后，Hsp70在處理75 d后表達(dá)量降低到對(duì)照的水平；隨后的低溫處理和發(fā)育幼蟲中3個(gè)基因表達(dá)水平基本維持恒定(圖5)。

圖4 4℃低溫(A和B)和自然變溫(C和D)處理不同時(shí)間后的麥紅吸漿蟲滯育幼蟲在24℃化蛹所需時(shí)間和累計(jì)化蛹率Fig. 4 Time required for pupation and cumulative pupation rates of Sitodiplosis mosellana diapausing larvae after exposedto low temperature (4℃) (A and B) and natural temperature (C and D) for different time prior to pupation at 24℃

圖5 EcR(A), Hsp70 (B)和Hsp90 (C)在低溫(4℃)終止滯育及24℃下滯育后發(fā)育麥紅吸漿蟲幼蟲中的表達(dá)水平Fig. 5 Expression levels of EcR (A), Hsp70 (B) and Hsp90 (C) in Sitodiplosis mosellana larvae during diapausetermination stimulated by low temperature (4℃), followed by developmental resumption at 24℃

3 討論

在滯育研究中，滯育強(qiáng)度或滯育發(fā)育速率通常以將滯育狀態(tài)的昆蟲轉(zhuǎn)移至解除滯育的條件后，滯育消除所需時(shí)間的長(zhǎng)短來(lái)衡量(Tauberetal., 1986; 賴錫婷等, 2008)。本研究中，我們采用自然變溫和4℃低溫處理麥紅吸漿蟲結(jié)繭滯育幼蟲(9月上旬)不同時(shí)間后轉(zhuǎn)移到正常發(fā)育溫度(24℃)的方法，研究了低溫對(duì)其滯育解除的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理0-60 d隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，幼蟲破繭率和化蛹率逐漸升高(圖1和3)，破繭和化蛹所需時(shí)間逐漸縮短(圖2和4)，說(shuō)明滯育強(qiáng)度逐漸降低，低溫在滯育解除中發(fā)揮作用。縱觀國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，低溫在昆蟲滯育解除中的作用大致可分為兩類：對(duì)一些昆蟲如始紅蝽Pyrrhocorisapterus(Ko?táletal., 2008)和綠盲蝽Apolyguslucorμm(卓德干等, 2011)低溫能促進(jìn)滯育解除，但不是滯育解除的依賴因素；還有一些昆蟲如果蠅Drosophilavirilis和Chymomyzacostata(Hodek and Hodková, 1988; Kostaletal., 2000)，滯育解除只能在低溫下進(jìn)行。本研究發(fā)現(xiàn)，9月上旬采集的未經(jīng)低溫處理的幼蟲(對(duì)照)70%以上能破繭，但均不能化蛹，即不能完成發(fā)育，說(shuō)明破繭率和破繭速率可反映昆蟲的滯育強(qiáng)度，但不能獨(dú)立作為滯育解除的指標(biāo)；同時(shí)說(shuō)明低溫是吸漿蟲滯育解除的依賴條件。自然變溫處理30-60 d的幼蟲(9-10月)化蛹率增幅明顯較4℃低溫處理的小，說(shuō)明4℃低溫對(duì)滯育解除的效果優(yōu)于9-10月的自然變溫。低溫處理≥60 d，自然變溫處理90 d(12月上旬)的幼蟲，破繭率和化蛹率均超過(guò)91%，且差異不明顯，破繭和化蛹所需時(shí)間達(dá)到最低且差異不明顯，說(shuō)明此時(shí)大部分幼蟲滯育已經(jīng)解除且種群內(nèi)個(gè)體發(fā)育一致，只要溫度升高馬上可恢復(fù)發(fā)育，然而由于低溫的作用處于滯育后靜息期(薛芳森等, 2001)。

大量研究表明，20E在幼蟲和蛹滯育解除中發(fā)揮重要作用，EcR在其信號(hào)傳導(dǎo)中扮演主要角色(李康等, 2011; Chenetal., 2016)。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，麥紅吸漿蟲自然滯育解除進(jìn)程中，20E滴度與EcR表達(dá)量變化趨勢(shì)一致，即在最冷的12月和1月最高，顯著高于滯育解除初期(9-11月)、靜息期后期(2月)和發(fā)育恢復(fù)期(3月)(成衛(wèi)寧等, 2009; 劉禹含, 2019)。這表明冬季低溫和光周期等環(huán)境因子對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞的刺激作用較強(qiáng)，促使其分泌較多的促前胸腺激素，最終使前胸腺分泌20E的量較多，EcR響應(yīng)并傳導(dǎo)20E信號(hào)在滯育解除中發(fā)揮作用。與此相同，4℃低溫處理顯著促進(jìn)EcR表達(dá)(圖5: A)，尤其30 d處理，不同的是EcR表達(dá)水平隨著滯育強(qiáng)度的降低而下降，說(shuō)明低溫對(duì)EcR表達(dá)的刺激作用強(qiáng)于自然解除滯育前期(9-11月)的變溫，盡管表達(dá)水平下降，相對(duì)短的時(shí)間累積(60 d)也足以促進(jìn)滯育解除。

眾所周知，Hsp屬于脅迫誘導(dǎo)蛋白，在昆蟲對(duì)熱冷、干旱等環(huán)境適應(yīng)中起著分子伴侶、增強(qiáng)抗逆能力等重要作用(Minami and Minami, 1999; Chenetal., 2005; Shilovaetal., 2018; Baietal., 2021)。也有研究表明，Hsp90和Hsp70參與昆蟲的正常發(fā)育和滯育過(guò)程，通過(guò)20E調(diào)控或者與EcR相互作用傳導(dǎo)20E信號(hào)發(fā)揮作用(Arbeitman and Hogness, 2000; Gilbertetal., 2000; Zhengetal., 2010)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在自然變溫解除滯育(Chengetal., 2016)還是4℃低溫解除滯育進(jìn)程中，麥紅吸漿蟲Hsp70和Hsp90表達(dá)量(圖5: B和C)與20E滴度和EcR表達(dá)量變化基本一致，說(shuō)明Hsp70和Hsp90在冬季耐寒性和滯育解除中發(fā)揮作用，但以何種方式參與滯育解除的調(diào)控，尚需通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)(如20E處理、pull-down或免疫共沉淀)來(lái)明確。

綜上所述，低溫處理能顯著促進(jìn)麥紅吸漿蟲的滯育解除，4℃低溫對(duì)滯育解除的效果優(yōu)于9-10月自然變溫，與11-12月變溫相當(dāng)；破繭率和破繭速率可作為評(píng)判結(jié)繭幼蟲滯育強(qiáng)度的參考，但不能獨(dú)立作為滯育解除的指標(biāo)；麥紅吸漿蟲EcR,Hsp70和Hsp90基因的表達(dá)水平與低溫解除滯育進(jìn)程相關(guān)，推測(cè)表達(dá)受20E調(diào)控或通過(guò)參與20E信號(hào)傳導(dǎo)在滯育解除中發(fā)揮作用。研究結(jié)果不僅為深入理解麥紅吸漿蟲滯育解除的分子機(jī)理，同時(shí)為提高室內(nèi)飼養(yǎng)技術(shù)、開展更為系統(tǒng)深入的研究奠定了良好基礎(chǔ)。