前列腺癌組織中Plexin-B1的表達及其與AR表達的相關(guān)性

盛仁明，侯 燕，劉加豪，張永勝，涂 健

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤，早期前列腺癌局限于前列腺內(nèi)，預(yù)后較好，若發(fā)生轉(zhuǎn)移較難診治。AR信號傳導(dǎo)對前列腺癌的進展至關(guān)重要，去勢治療是前列腺癌的重要治療手段，而去勢抵抗性前列腺癌是患者發(fā)生耐藥及死亡的重要原因[1]。Plexin-B1是信號素Sema4D的跨膜受體[2]，其在前列腺癌中通過Sema4D/Plexin-B1信號通路激活HER-2以及雄激素受體，促進腫瘤的侵襲性[3]。本實驗采用免疫組化EnVision法染色、qRT-PCR法檢測Plexin-B1 蛋白和mRNA在前列腺癌和良性前列腺組織中的表達，分析其表達水平與前列腺癌臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2009年1月～2011年1月蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科存檔的82例前列腺癌組織和46例良性前列腺組織，前列腺癌的組織學(xué)類型均為腺泡腺癌。82例前列腺癌患者年齡55～94歲，平均72.9歲，>70歲者51例，≤70歲者31例。按照AJCC(2017)分期標準進行分期：Ⅰ+Ⅱ期者35例，Ⅲ+Ⅳ期者47例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例?；颊呔?jīng)手術(shù)切除治療，術(shù)前均未行放、化療或抗雄激素等治療。按WHO/ISIP(2016)分級分組系統(tǒng)[4]將前列腺癌分為1～5組。82例前列腺癌患者隨訪3～120個月。

1.2 試劑Plexin-B1兔抗人抗體購自Abcam公司，AR的兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德生物公司。免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋公司。Trizol提取試劑盒購自上海宏生生物公司，qRT-PCR擴增試劑盒購自南京諾唯贊生物公司。

1.3 免疫組化標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片。免疫組化染色采用EnVision法，一抗包括Plexin-B1(1 ∶200)、AR(1 ∶300)，4 ℃孵育過夜，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性染色的前列腺癌切片作為陽性對照。

Plexin-B1陽性結(jié)果判斷參考文獻[5-6]進行：(1)按陽性細胞染色程度計分：不著色或顯色不清為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細胞百分比計分：陽性細胞數(shù)<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。將兩項得分結(jié)果相乘：總分<3分為陰性(-)，≥3且<6分為陽性(+)，≥6分為強陽性()。

1.4 qRT-PCR采用Trizol試劑盒提取20對前列腺癌和良性前列腺組織的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR檢測Plexin-B1 mRNA基因的表達。Plexin-B1引物序列：上游5′-GGCGAGGATA CACCAGCAG-3′，下游5′-GTGCAAAGGCACTCACG AA-3′。內(nèi)參β-actin引物序列：上游5′-CACCATTG GCAATGAGCGGTTCC-3′，下游5′-GTAGTTTCGTG GATGCCACAGG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，合計40個循環(huán)；進行熔解曲線檢測。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，配對資料的比較采用配對t檢驗，采用Spearman進行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌和良性前列腺組織中Plexin-B1的表達Plexin-B1陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位于細胞胞核，胞質(zhì)淺著色，間質(zhì)細胞未著色。前列腺癌組織中Plexin-B1的陽性率為74.39%(61/82)。良性前列腺組織中Plexin-B1的陽性率為10.87%(5/46)。前列腺癌組織中Plexin-B1陽性率顯著高于良性前列腺組織，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1，圖1)。

表1 前列腺癌和良性前列腺組織中Plexin-B1的表達

AB

2.2 前列腺癌組織中Plexin-B1的表達及與臨床病理特征的關(guān)系臨床分期Ⅰ+Ⅱ期前列腺癌中Plexin-B1的陽性率為61.54%，Ⅲ+Ⅳ期前列腺癌中Plexin-B1的陽性率為86.05%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.021)。WHO/ISUP(2016)分級分組中1～5組前列腺癌的Plexin-B1蛋白陽性率分別為75.00%、70.00%、60.00%、83.33%、82.35%，5組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)，Plexin-B1蛋白表達與患者年齡、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、脈管及神經(jīng)有無侵犯等均無關(guān)(P>0.05，表2)。

表2 前列腺癌組織中Plexin-B1的表達及與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 前列腺癌及良性前列腺組織中Plexin-B1 mRNA的表達qRT-PCR檢測20對前列腺癌和良性前列腺組織，結(jié)果顯示：Plexin-B1 mRNA相對表達量在前列腺癌中為(267.15±57.06)%，在良性前列腺組織中為(100.00±19.02)%。這提示Plexin-B1 mRNA在前腺癌組織中的表達水平高于良性前列腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 Plexin-B1表達與前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，Plexin-B1高表達組10年生存率為55.74%，Plexin-B1低表達組10年生存率為85.71%。結(jié)果表明，前列腺癌組織中Plexin-B1高表達組的生存率低于Plexin-B1低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019，圖2)。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析Plexin-B1表達與前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.5 前列腺組織中Plexin-B1與AR表達的相關(guān)性免疫組化檢測Plexin-B1和AR在前列腺癌組織中的表達，結(jié)果顯示：Plexin-B1陽性組AR陽性率為86.89%，Plexin-B1陰性組AR陽性率為61.90%。Spearsman等級相關(guān)分析顯示，Plexin-B1與AR的表達呈正相關(guān)(r=0.275，P=0.012，表3)。

表3 前列腺癌組織中Plexin-B1和AR表達的相關(guān)性

3 討論

脊椎動物中Plexin蛋白家族有9個成員，分成4個亞組，包括：Plexin-A、Plexin-B、Plexin-C、Plexin-D；其中Plexin-B有3個成員：Plexin-B1、Plexin-B2和Plexin-B3。Plexin-B1屬于跨膜蛋白分子，其由2 315個氨基酸組成，mRNA長7 097 bp，其cDNA長6 467 bp[7]。研究證實Plexin-B1在惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌、鱗狀細胞癌等腫瘤中高表達，并促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。文獻報道，Plexin-B1蛋白作為Sema4D的受體在多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管新生等方面發(fā)揮重要作用[10-11]。目前，Plexin-B1與前列腺癌的相關(guān)性尚未見報道。本實驗結(jié)果表明，Plexin-B1在前列腺癌細胞膜、胞質(zhì)和胞核中高表達，尤以細胞核的表達水平最高，提示Plexin-B1可能在前列腺癌中起作用。

研究表明，在前列腺癌中Plexin-B1基因突變導(dǎo)致Plexin-B1介導(dǎo)的相關(guān)通路缺失抑制了腫瘤細胞的侵襲性[12-15]。在前列腺癌中Plexin-B1可以通過激活癌基因HER-2和c-Met調(diào)節(jié)小GTP酶RhoA、R-Ras和Rap1b與Rac、Rnd和RhoD相互作用，導(dǎo)致肌動蛋白細胞骨架和細胞的活動[16-17]。在晚期前列腺癌中Sema4D/Plexin-B1信號通路可能通過激活HER-2和Plexin-B1基因突變，促進前列腺癌的侵襲性，該過程與在乳腺癌中的過程相似[18-19]。本實驗發(fā)現(xiàn)，Plexin-B1在前列腺癌組織中的表達水平高于正常前列腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用qRT-PCR檢測20對前列腺癌組織和良性前列腺組織，結(jié)果表明：Plexin-B1 mRNA在前腺癌組織中的表達水平高于良性前列腺組織，提示Plexin-B1在前列腺癌中表達水平出現(xiàn)異常，其可能導(dǎo)致了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

本實驗進一步分析Plexin-B1的表達和前列腺癌臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明：Plexin-B1在前列腺癌組織中過表達，與臨床分期、WHO/ISUP密切相關(guān)。生存分析結(jié)果表明Plexin-B1高表達的患者總生存率低于低表達患者。文獻報道Plexin-B1可以通過一系列通路，促進PI3K、AKT、ERK/MAPK等分子磷酸化狀態(tài)發(fā)生變化，使前列腺癌細胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并導(dǎo)致腫瘤的遷徙、侵襲能力增強，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移[20]。在乳腺癌中Plexin-B1可以通過解離淋巴管間質(zhì)促進癌細胞的擴散，從而導(dǎo)致患者預(yù)后不良[21]。本實驗結(jié)果與文獻報道相符，其機制還有待于進一步分析。

AR信號通路在前列腺癌中發(fā)揮重要作用，去勢治療是治療進行性前列腺癌的標準療法。而去勢抵抗前列腺癌對該療法的抵抗產(chǎn)生了與配體無關(guān)的AR信號，其必須進入細胞核作為轉(zhuǎn)錄因子激活基因轉(zhuǎn)錄才能發(fā)揮作用[22]。因此，AR到細胞核的過程是潛在治療靶點，成為近年研究熱點。研究表明，多西紫杉醇和強的松治療的去勢抵抗治療使前列腺癌患者的生存率明顯增加，其與微管蛋白結(jié)合并抑制微管依賴性AR向細胞核的轉(zhuǎn)運[23]。研究表明Plexin-B1信號通路可能通過促進AR向細胞核的轉(zhuǎn)運，促進前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展[24]。

本實驗結(jié)果表明Plexin-B1和AR的蛋白表達水平具有相關(guān)性，其相互作用，可能促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Plexin-B1蛋白作為Sema4D的受體[25]在前列腺癌進展中具有重要作用，有望成為新治療靶點。Plexin-B1在前列腺癌中具體生物學(xué)機制仍需要進一步分析，可能提高前列腺癌患者的早期診斷效率，有望成為靶向治療的新靶點。