梨火疫病檢測技術(shù)研究與推廣應(yīng)用

董 歡

（新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳哈密植物檢疫工作站，新疆 哈密 839001）

梨火疫病是由噬淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovora）引起的一種極具毀滅性的細(xì)菌性病害，可危害包括梨、蘋果、山楂、李等在內(nèi)的40 多個(gè)屬、220 多種薔薇科植物。風(fēng)、雨、鳥類、昆蟲均對(duì)該病有一定傳播擴(kuò)散作用，遠(yuǎn)距離傳播途徑主要為感病寄主的種苗、接穗、砧木等繁殖材料以及被污染的包裝材料、運(yùn)輸工具等。目前梨火疫病在北美、中美、歐洲、西亞等多國均有分布，是《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物》中規(guī)定的一類危險(xiǎn)性病害。

一、梨火疫病檢測技術(shù)

梨火疫病極具毀滅性，世界各國及地區(qū)均將該病的快速、準(zhǔn)確檢測技術(shù)列為重要研究課題，旨在通過靈敏、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)降低該病通過貿(mào)易流通傳入國內(nèi)的機(jī)率。

1、傳統(tǒng)檢測技術(shù)

（1）選擇性培養(yǎng)基法

選擇性培養(yǎng)基是一種傳統(tǒng)的梨火疫病菌檢測方法，常通過多種培養(yǎng)基結(jié)合使用以達(dá)到精準(zhǔn)檢測和鑒定目的?；驹硎歉鶕?jù)梨火疫病菌在不同培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出的菌落特征、顏色達(dá)到快速鑒定的目的。多以半選擇性培養(yǎng)基為主，各類培養(yǎng)基均有不同優(yōu)缺點(diǎn)。MS 培養(yǎng)基上的菌落為橙紅色，邊緣光滑透明；但該配方復(fù)雜，不易儲(chǔ)存。CG 培養(yǎng)基成分簡單，但菌落形成特征不穩(wěn)定，菌落識(shí)別需要一定經(jīng)驗(yàn)。TTC 培養(yǎng)基上的菌落為獨(dú)特的紅色肉瘤狀，易識(shí)別。CCT 培養(yǎng)基上菌落為黃色帶藍(lán)色邊緣菌落，常用于檢測無癥狀蘋果花、芽和潰瘍斑上的梨火疫病菌。Zeller 改良培養(yǎng)基經(jīng)設(shè)計(jì)改良配方簡易，但易與在該培養(yǎng)基上的某些菌落混淆。

（2）致病性測定

檢測分離得到的梨火疫病菌通常需要進(jìn)行致病性測定。一般采用幼梨或幼苗測定分離物的致病性，特征性明顯的菌膿則視為梨火疫病菌。張樂等利用離體巴梨枝條測定梨火疫病菌的致病性，接種的枝條在28℃條件下保濕培養(yǎng)，如果是梨火疫病菌，60 h 后可見接種孔有白色菌膿流出，若接種孔干燥則不是梨火疫病菌[1]。

（3）免疫學(xué)檢測技術(shù)

應(yīng)用于植物病原細(xì)菌的免疫學(xué)檢測技術(shù)主要為酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、玻片凝集技術(shù)、免疫分離等。檢測結(jié)果獲得時(shí)間相對(duì)較短，但會(huì)受限于血清質(zhì)量和?；?。謝洪芳等[2]將半選擇性培養(yǎng)基與常規(guī)免疫方法相結(jié)合，使檢測靈敏度達(dá)到了每毫升10～100 個(gè)細(xì)胞。胡白石等[3]建立的膜上免疫分離技術(shù)成功對(duì)梨火疫病菌進(jìn)行了檢測，提高了可操作性。2003 年胡白石等[4]利用梨火疫病菌脂多糖制備了抗血清，建立了間接免疫熒光染色法和協(xié)同凝集法檢測梨火疫病菌，具有耗時(shí)短、轉(zhuǎn)化性好的特點(diǎn)，適合口岸工作需求。

2、分子檢測技術(shù)

PCR 檢測技術(shù)自建立起就被廣泛應(yīng)用于微生物?；挽`敏度檢測。隨著方法學(xué)的發(fā)展進(jìn)步，PCR 技術(shù)在傳統(tǒng)應(yīng)用基礎(chǔ)上與其他技術(shù)相結(jié)合，衍生出靈敏度更高、?；愿玫臋z測技術(shù)。

（1）PCR 技術(shù)

1996 年，謝云陸[5]建立了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測梨火疫菌技術(shù)，梨火疫菌檢出最低帶菌量為50 個(gè)。PCR 技術(shù)具有特異、靈敏和快速的特點(diǎn)，但影響因素較多，直接影響擴(kuò)增結(jié)果。

（2）實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)

2006 年，錢國良、胡白石等[6]根據(jù)梨火疫病菌16～23 S間的ITS 保守序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物REA/FEA，應(yīng)用熒光燃料SYBR Green I，對(duì)10 個(gè)梨火疫菌株及參試菌株進(jìn)行檢測，成功建立了梨火疫病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測方法，檢測靈敏度達(dá)到4 個(gè)細(xì)胞，比常規(guī)PCR 電泳檢測提高10 倍。

（3）一步雙重PCR 法

2008 年許景升等[7]將來自染色體序列的引物和pEA29 質(zhì)粒序列的引物放在1 個(gè)PCR 反應(yīng)體系中，同時(shí)擴(kuò)增得到1.6 kb 和1.0 kb 的2 條擴(kuò)增帶，建立了快速、準(zhǔn)確檢測梨火疫病菌的一步雙重PCR 技術(shù)。該技術(shù)彌補(bǔ)了僅依賴pEA29 質(zhì)粒序列檢測方法存在的缺陷，最小檢出菌量可達(dá)到3 個(gè)。而且，此技術(shù)可直接采用細(xì)菌菌體為模板檢測梨火疫病菌，省去了繁瑣耗時(shí)的DNA提取過程。

（4）免疫捕獲（吸附）PCR 檢測法

2010 年，何丹丹等[8]利用被包被在PCR 管壁的抗體特異性吸附目的細(xì)菌，洗滌除去樣品處理液中的大部分PCR 反應(yīng)抑制物質(zhì)，建立了梨火疫病菌免疫捕獲PCR 方法，檢測靈敏度達(dá)到了1.5×102cfu/reaction，較PCR 法靈敏度提高10 倍以上，且省去了DNA 提取步驟。同年，蘇梅華等[9]同樣利用特異抗血清包被PCR 管吸附靶標(biāo)細(xì)菌的原理，建立了免疫吸附PCR 方法。免疫捕獲（吸附）PCR 技術(shù)準(zhǔn)確靈敏，對(duì)設(shè)備要求不高，極具在口岸一線檢疫部門推廣使用的潛力。

（5）實(shí)時(shí)熒光PCR 和誘捕PCR-ELISA 檢測方法

2003 年朱建裕等[10]設(shè)計(jì)了1 對(duì)引物和3 條探針，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測方法和誘捕PCR-ELISA 檢測方法。實(shí)時(shí)熒光PCR 采用帶熒光標(biāo)記的核酸雜交探針，避免了假陽性和交叉污染。誘捕PCR-ELISA 檢測方法只需簡單處理的樣品就能檢測，由于增加了核酸雜交探針，故不需凝膠電泳EB 染色檢測，避免了假陽性問題。

3、多光譜遙感技術(shù)

2020 年Nikrooz Bagheri[11]提出了利用多光譜遙感技術(shù)對(duì)梨園的葉綠素含量和樹冠密度進(jìn)行測定，采用地面多光譜成像技術(shù)對(duì)健康樹木葉片、無癥狀病葉和有癥狀病葉進(jìn)行成像研究。樹冠的航空多光譜成像則利用無人機(jī)完成，然后對(duì)地面和空中圖像進(jìn)行預(yù)處理和處理。通過計(jì)算某些植被指數(shù)來檢測感染葉片，分類總體準(zhǔn)確率達(dá)到95.0%，是一種可靠的早期檢測梨火疫病的方法。

二、快速檢測方法及其應(yīng)用

羅明、袁英哲等人2020 年6 月5 日發(fā)明專利申請(qǐng)：一種快速檢測梨火疫病菌活菌的方法及應(yīng)用。該方法的原理是實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測方法，即根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的擴(kuò)增曲線和獲得的Ct 值，確定檢測樣品中梨火疫病菌的存活狀態(tài)。當(dāng)檢測樣品Ct 值＜35，判定為陽性，即檢測樣品中含有梨火疫病菌活菌；當(dāng)Ct值≥35，判定為陰性，即檢測樣品中不含有梨火疫病菌活菌。該方法可應(yīng)用于對(duì)梨火疫病感病果樹枝條、葉片、花、果實(shí)中梨火疫病菌活菌的定性和定量檢測。

三、結(jié)語

梨火疫病是一種極具毀滅性的病害，加強(qiáng)進(jìn)境植物及其產(chǎn)品、包裝材料的檢疫，嚴(yán)格落實(shí)檢疫管理措施，最大限度降低其傳入風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)切實(shí)保護(hù)全國產(chǎn)業(yè)安全具有極為重要的意義。篩選抗病的砧木與接穗、培育優(yōu)良的抗病品種是對(duì)梨火疫病最有效、經(jīng)濟(jì)的防控措施。