熒光分子印跡傳感器快速檢測微生物活性及其毒素分析

趙梁 沈陽市疾病預(yù)防控制中心設(shè)備科 （遼寧 沈陽 110032）

內(nèi)容提要：目的：探討熒光分子印跡傳感器快速檢測微生物活性及其毒素的效果。方法：采用熒光分子印跡傳感器快速檢測細(xì)菌活性和真菌毒素，分別制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物模板和玉米赤霉烯酮結(jié)構(gòu)類似物2,4-二羥基苯甲酸環(huán)十二酯熒光分子印跡聚合物模板，建立熒光分子印跡聚合物傳感器，分析其對實際樣品中細(xì)菌活性和真菌毒素的快速測定結(jié)果。結(jié)果：大腸桿菌熒光分子印跡聚合物與目標(biāo)菌結(jié)合后，可使其熒光強(qiáng)度降低，與熒光空白印跡聚合物結(jié)合后，熒光強(qiáng)度降低則不明顯。熒光分子印跡傳感器對50μg/L玉米赤霉烯酮濃度牛奶中玉米赤霉烯酮的檢測濃度與回收率均顯著低于超高靈敏度液相色譜檢測，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。熒光分子印跡傳感器對100μg/L、200μg/L玉米赤霉烯酮濃度牛奶中玉米赤霉烯酮的檢測濃度與回收率，與超高靈敏度液相色譜檢測比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：熒光分子印跡傳感器對細(xì)菌活性和真菌毒素的快速檢測效果良好，準(zhǔn)確性可靠，與超高靈敏度液相色譜檢測效果基本一致，具有檢測準(zhǔn)確、回收率、檢測快速、操作簡單等優(yōu)點，但低濃度真菌毒素檢測準(zhǔn)確性有待提升，該檢測方法應(yīng)用價值較高。

熒光細(xì)菌印跡傳感器為現(xiàn)代化學(xué)檢驗的新技術(shù)，近年來該技術(shù)迅速發(fā)展進(jìn)步，其在食品、環(huán)境等領(lǐng)域中應(yīng)用逐漸較多，具有檢測便捷、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)勢[1,2]。但是，熒光細(xì)菌印跡傳感器快速檢測細(xì)菌活性的研究較少，有必要展開針對性研究。為此，本次研究建立了大腸桿菌和玉米赤霉烯酮的熒光分子印跡聚合物模板，并連接酶標(biāo)儀，組建傳感器，針對性檢測了細(xì)菌活性和真菌毒素，并參照超高靈敏度液相色譜檢測結(jié)果，分析了熒光分子印跡傳感器快速檢測的有效性，現(xiàn)總結(jié)報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

試劑：玉米赤霉烯酮、鹽酸多巴胺、丹磺酞氯、乙腈（色譜純）、三羥基甲基氨基甲烷、碳酸氫鈉、鹽酸、乙酸、硼砂、石油醚、乙酚、乙醇、聚乙二醇8000均為分析純。大腸桿菌噬菌體f2、T4、M13來源：華中科技大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所提供。實驗所用水均為去離子水。

儀器設(shè)備：Gen 5Biotek多功能酶標(biāo)儀（美國）、Agilent 1200高效液相儀及配套熒光檢測器（美國）、Supelclean LC-18固相萃取小柱（美國）、EFAA-DC24-RT氮吹儀和QLSPA氮氣發(fā)生器（上海安譜實驗科技股份有限公司）、電熱恒溫水槽（DK-8A）、eppendorf，Centrifuge 5810 R高速低溫離心機(jī)（德國）等[3]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌活性檢測

新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌接種于10mL LB培養(yǎng)液，培養(yǎng)后取處于對數(shù)生長期的大腸桿菌，接種于含0.7%瓊脂LB培養(yǎng)基試管，49°C恒溫水浴保溫，SM緩沖溶液10倍稀釋，取100μL含活菌溶液制作3個平行樣，另對同類溶液進(jìn)行高溫滅菌處理，制作熒光空白印跡聚合物模板。以完整活菌（大腸桿菌）為模板，選擇熒光功能單體（丹磺酞多巴胺），通過多巴胺氧化自聚合反應(yīng)，制備熒光分子印跡聚合物模板，將細(xì)菌熒光分子印跡聚合物與多功能酶標(biāo)儀合用，建立熒光分子印跡聚合物傳感器，評價其對傳感器的線性關(guān)系。分析其對實際樣品中細(xì)菌活性快速測定效果[4]。

1.2.2 真菌毒素檢測

普通市售純牛奶每2mL分為1份，共分出60份，其中20份加入50μg/L，20份加入100μg/L，20份加入200μg/L玉米赤霉烯酮，乙睛渦旋混勻后超聲提取，離心收集上清，重復(fù)此過程提取一遍殘渣，兩次上清液混合，固相萃取小柱凈化樣品。不同濃度樣品均分為兩份，每份含三種濃度樣品各10份，分別進(jìn)行熒光分子印跡傳感器快速檢測和超高靈敏度液相色譜檢測。

以玉米赤霉烯酮結(jié)構(gòu)類似物2,4-二羥基苯甲酸環(huán)十二酯作為偽模板，選擇熒光功能單體（多巴胺功能單體），合成分子印跡聚合物，連接酶標(biāo)儀，組建傳感器，評價傳感器檢測的玉米赤霉烯酮線性關(guān)系，據(jù)此監(jiān)測牛奶中ZON進(jìn)行檢測（模板洗脫液為0.2 mmoI/L NaHCO3），收集監(jiān)測結(jié)果，與超高靈敏度液相色譜檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計熒光分子印跡傳感器快速檢測對細(xì)菌活性和真菌毒素的檢查結(jié)果，分析其檢測效果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析所有數(shù)據(jù)，以±s表示計量資料，采用t檢驗；以（%，n）表示計數(shù)資料，采用χ2檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 大腸桿菌活性檢測結(jié)果分析

大腸桿菌熒光分子印跡聚合物與目標(biāo)菌結(jié)合后，可使其熒光強(qiáng)度降低，與熒光空白印跡聚合物結(jié)合后，熒光強(qiáng)度降低則不明顯，大腸桿菌傳感器熒光分子印跡聚合物對活菌的識別能力遠(yuǎn)大于死菌，不同熒光分子印跡聚合物對應(yīng)噬菌體的熒光響應(yīng)（fMIPs為熒光分子印跡聚合物，fNIPs為熒光空白印跡聚合物，P＜0.05）。

2.2 熒光分子印跡傳感器和超高靈敏度液相色譜檢測結(jié)果比較

熒光分子印跡傳感器對50μg/L玉米赤霉烯酮濃度牛奶中玉米赤霉烯酮的檢測濃度與回收率均顯著低于超高靈敏度液相色譜檢測，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。熒光分子印跡傳感器對100μg/L、200μg/L玉米赤霉烯酮濃度牛奶中玉米赤霉烯酮的檢測濃度與回收率，與超高靈敏度液相色譜檢測比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1.熒光分子印跡傳感器和超高靈敏度液相色譜對不同濃度玉米赤霉烯酮濃度檢測結(jié)果比較(±s)

表1.熒光分子印跡傳感器和超高靈敏度液相色譜對不同濃度玉米赤霉烯酮濃度檢測結(jié)果比較(±s)

分組 檢測濃度(μg/L) 回收率(%)玉米赤霉烯酮濃度 50μg/L 100μg/L 200μg/L 50μg/L 100μg/L 200μg/L熒光分子印跡傳感器檢測 48.03±2.03 101.23±1.98 189.28±2.02 97.02±1.56 101.74±1.42 100.04±0.97超高靈敏度液相色譜檢測 53.18±1.98 104.73±2.34 185.02±2.03 104.23±2.47 104.96±2.16 92.03±2.65 t 4.054 0.818 1.258 3.859 0.429 0.674 P 0.023 0.187 0.226 0.038 0.521 0.231

3.討論

微生物及其毒素檢測是醫(yī)藥、衛(wèi)生及食品、工業(yè)生產(chǎn)等多個行業(yè)質(zhì)量檢測的重要內(nèi)容，必須嚴(yán)格控制微生物及其毒素含量，確保產(chǎn)品符合相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。微生物活性是決定其侵襲力的重要指標(biāo)，其毒素分泌量又是衡量其毒力、危害性的關(guān)鍵指標(biāo)，因而必須積極探明微生物活性及其毒素情況，進(jìn)而為疾病診斷、治療、分析提供客觀依據(jù)。目前，常用的細(xì)菌鑒別、診斷技術(shù)較多，但是檢測操作復(fù)雜、周期較長，同時缺乏針對微生物活性和毒素的檢測方法，因而必須積極尋找更為快速、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)[5]。

超高效液相色譜是一種新型的化學(xué)物質(zhì)分析方法，廣泛應(yīng)用于臨床檢驗、藥物分析、工業(yè)生產(chǎn)等行業(yè)中，具有超高速度、超高分離度、超高靈敏度等優(yōu)勢，是一種較為準(zhǔn)確的檢測技術(shù)。微生物及其毒素含有大量的大分子蛋白質(zhì)，而超高效液相色譜檢測法對大分子蛋白質(zhì)的檢測效果較好，可完成定性及定量檢測，為臨床診斷、治療、預(yù)后評估提供可靠的參考依據(jù)。目前，超高效液相色譜的分析速度顯著提升，但是其分析體系較為復(fù)雜，操作難度較高，檢測時間相對較長，需積極優(yōu)化改進(jìn)，提升其檢測效率，同時也應(yīng)保證其檢測準(zhǔn)確性和有效性[6,7]。熒光分子印跡傳感器快速檢測技術(shù)是一類新型化學(xué)物質(zhì)分析方法，其檢測效果較好，靈敏度較高，且特異性良好，分析體系不斷優(yōu)化，分析速度加快，在檢測準(zhǔn)確性和檢測效果方面具有較好的優(yōu)勢。熒光分子印跡聚合物可特異性識別并結(jié)合模板分子，因而具有良好的參考價值，可作為傳感器的識別元件，與多功能酶標(biāo)儀合用，建立熒光分子印跡傳感器，其可完成高通量、靈敏、準(zhǔn)確檢測[8]。近年來，熒光分子印跡傳感器快速檢測技術(shù)發(fā)展盡快，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及工業(yè)生產(chǎn)中，成為大分子蛋白質(zhì)等有機(jī)物的重要檢測技術(shù)，可對多種有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行定性及定量檢測。目前，細(xì)菌、真菌相關(guān)的熒光分子印跡傳感器檢測逐漸增多，可通過表位印跡或全微生物印跡進(jìn)行實際檢測，但是文獻(xiàn)研究相對較少[9,10]。為此研究對熒光分子印跡傳感器檢測細(xì)菌活性分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌熒光分子印跡聚合物與目標(biāo)菌結(jié)合后，可使其熒光強(qiáng)度降低，與熒光空白印跡聚合物結(jié)合后，熒光強(qiáng)度降低則不明顯，不同熒光分子印跡聚合物對應(yīng)噬菌體的熒光響應(yīng)（fMIPs為熒光分子印跡聚合物，fNIPs為熒光空白印跡聚合物）可知大腸桿菌熒光分子印跡聚合物與目標(biāo)菌結(jié)合后，可降低其熒光強(qiáng)度，與熒光空白印跡聚合物結(jié)合后，熒光強(qiáng)度降低則不明顯，大腸桿菌熒光分子印跡聚合物具有較高的敏感性，且大腸桿菌傳感器熒光分子印跡聚合物對活菌的識別能力遠(yuǎn)大于死菌，檢測細(xì)菌活性能力較強(qiáng)。此外，應(yīng)進(jìn)一步明確熒光分子印跡傳感器快速檢測對微生物毒素的檢測效果，為此本次研究對玉米赤霉烯酮濃度的真菌毒素檢測進(jìn)行了對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：玉米赤霉烯酮濃度50μg/L、100μg/L、200μg/L樣本：熒光分子印跡傳感器檢測濃度分別為（48.03±2.03）μg/L、（101.23±1.98）μg/L、（189.28±2.02μg/L，回收率分別為（97.02±1.56）%、（101.74±1.42）%、（100.04±0.97）%；玉米赤霉烯酮濃度50μg/L、100μg/L、200μg/L樣本：超高靈敏度液相色譜檢測濃度分別為（53.18±1.98）μg/L、（104.73±2.34）μg/L、（185.02±2.03）μg/L；回收率分別為（104.23±2.47）%、（104.96±2.16）%、（92.03±2.65）%，可知熒光分子印跡傳感器對100μg/L、200μg/L玉米赤霉烯酮濃度牛奶中玉米赤霉烯酮的檢測濃度與回收率，與超高靈敏度液相色譜檢測比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；提示熒光分子印跡傳感器對100μg/L、200μg/L玉米赤霉烯酮濃度牛奶中玉米赤霉烯酮的檢測結(jié)果、回收率，均與超高靈敏度液相色譜檢測差異較小，可知其準(zhǔn)確性較為可靠，可有效檢出玉米赤霉烯酮，為真菌毒素檢測提供了新的途徑。但是，需注意熒光分子印跡傳感器對50μg/L玉米赤霉烯酮濃度牛奶中玉米赤霉烯酮的檢測濃度與回收率均顯著低于超高靈敏度液相色譜檢測，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示熒光分子印跡傳感器快速檢測對相對較低濃度的玉米赤霉烯酮檢測效果存在一定不足，牛奶中低濃度（50μg/L）的玉米赤霉烯酮，熒光分子印跡傳感器快速檢測的檢出濃度相對較低，存在回收率偏低等問題，應(yīng)高度警惕，在低濃度微生物毒素檢測中，考慮聯(lián)用其他檢測方法，以提升檢測準(zhǔn)確性。

綜上所述，熒光分子印跡傳感器對細(xì)菌活性和真菌毒素的快速檢測效果良好，準(zhǔn)確性可靠，與超高靈敏度液相色譜檢測效果基本一致，具有檢測準(zhǔn)確、回收率、檢測快速、操作簡單等優(yōu)點，同時其對活菌的識別能力遠(yuǎn)大于死菌，可有效鑒別細(xì)菌活性，但低濃度真菌毒素檢測準(zhǔn)確性有待提升，該檢測方法應(yīng)用價值較高。