微量大鼠血漿中對(duì)乙酰氨基酚的LC/M S/M S定量檢測(cè)方法的建立

張 亮，廖宏俊，丁文杰，王小雪，郁 杰

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

非那西丁的體內(nèi)代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚，又名泰諾林、必理通、百服寧。對(duì)于治療普通感冒引起的發(fā)熱以及緩解頭疼，關(guān)節(jié)疼等有良好的效果。作為分析化學(xué)的一個(gè)分支，生物分析廣泛的應(yīng)用于外源性物質(zhì)（化學(xué)合成或天然提取的候選藥物，基因改造的生物分子及它們的代謝產(chǎn)物或轉(zhuǎn)化后再修飾的產(chǎn)物）和生物系統(tǒng)中生物大分子（蛋白質(zhì)、DNA、大分子藥物和代謝產(chǎn)物）等的定量測(cè)定。

LC/MS技術(shù)是以質(zhì)譜為檢測(cè)手段的色譜技術(shù)，它既有液相色譜的高分離能力也有質(zhì)譜的高靈敏度和高專屬性。在藥物微量雜質(zhì)、藥物降解產(chǎn)物、及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析鑒定、藥代動(dòng)力學(xué)等研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。本文采用LC/MS/MS建立了微量大鼠血漿中對(duì)乙酰氨基酚的定量檢測(cè)方法，并進(jìn)行了方法學(xué)的驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備及軟件系統(tǒng)儀器：AB SCIEX公司的Triple Quad 6500plus；Shimadzu LC-30AD超高效液相色譜儀和SIL-30ACMP自動(dòng)進(jìn)樣器；大龍MX-S渦旋混合儀；Eppendorf 5810R低溫高速離心機(jī)。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：Analyst 1.6.3。

1.2 試劑和動(dòng)物大鼠血漿購(gòu)于BioreclamationINT，批號(hào)RAT353600；Acetaminophen-d4購(gòu)自于Toronto Research Che micals Inc，批號(hào)：A161222；4-Acetamidophenol購(gòu)自于梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：5IXZK；甲醇購(gòu)于SIGMA（色譜純）；乙腈購(gòu)于SIGMA（色譜純）；還有去離子水，及其它分析純?cè)噭?/p>

4-Acetamidophenol儲(chǔ)備液：室溫黃光條件下精密稱取4-Acetamidophenol 2.531mg，放入玻璃瓶中，后加入2.531mL DMSO溶解，然后用50%ACN稀釋儲(chǔ)備液，得到濃度為1000ng/mL，2000ng/mL，10000ng/mL，50000ng/mL，200000ng/mL，400000ng/mL，800000ng/mL，1000000ng/mL的 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線工作液，以及質(zhì)控樣品工作液LLOQ QC，LQC，GMQC，MQC，HQC，濃度分別為（1000ng/mL，3000ng/mL，20000ng/mL，500000ng/mL，750000ng/mL），于-30℃到-10℃條件下儲(chǔ)存。

Acetaminophen-d4儲(chǔ)備液：室溫黃光條件下精密稱取Acetaminophen-d4 2.135 mg，放入玻璃瓶中，然后加入2.135mL DMSO溶解即為所需工作液，然后用50%ACN稀釋得到1000 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，并于-30℃到-10℃條件下儲(chǔ)存。

1.3 液相色譜與質(zhì)譜參數(shù)

（1）色譜條件：色譜柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm；流動(dòng)相：流動(dòng)相B：0.1%FA and 2mM NH4OAc in H2O；流動(dòng)相A：0.1%FA and 2mM NH4OAc in ACN/H2O（95:5；v:v）；洗液：R3:0.1%FA in ACN/MeOH/IPA/H2O(1:1:1:1，v:v:v:v)；R0，R1：50% MeOH；流 速：0.400 mL/min，柱溫：40℃；進(jìn)樣量：15μL。

（2）質(zhì)譜條件：溶劑揮發(fā)溫度600℃，電噴霧離子源（ESI）正離子模式，離子源噴射電壓為5000V，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），分析物4-Acetamidophenol離子對(duì)為152.2/110.2，內(nèi)標(biāo)Acetamidophenol-d4離子對(duì)為156.2/114.2。

1.4 樣品前處理在室溫條件下融解樣品，并逐個(gè)渦旋。取10.0μL標(biāo)曲樣品、質(zhì)控樣品或測(cè)試樣品，對(duì)于雙空白樣品和單空白樣品取10.0μL空白基質(zhì)加入到新96深孔板中。在雙空白樣品孔中加入30.0μL 50% ACN，對(duì)其它孔內(nèi)，分別加入30.0μL內(nèi)標(biāo)工作溶液（1000ng/mL），混合均勻。

向每個(gè)樣品孔內(nèi)添加260μL 0.1%的甲酸乙腈溶液，封96孔板，渦旋約10min，然后于4℃，3200×g條件下離心10min。取30.0μL上清至另一新96孔板中，每個(gè)樣品孔中添加570μL去離子水，渦旋至少5min。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得及方法的專屬性測(cè)定用移液器吸取190μL空白大鼠血漿至離心管中，然后分別加入10.0μL標(biāo)曲和質(zhì)控樣品工作液，渦旋混勻，即得到濃度為50.0ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，2500ng/mL，10000ng/mL，20000ngmL，40000ng/mL，50000ng/mL標(biāo)曲和質(zhì)控樣品。

在分析批的開(kāi)始加入雙空白樣品和單空白樣品，然后加入標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，并在分析批的最后再加入一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)液相質(zhì)譜得到相關(guān)數(shù)據(jù)，用Analyst軟件進(jìn)行擬合，得到如圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。如圖2、圖3、圖4分別是雙空白樣品圖譜、單空白樣品圖譜及定量下限樣品譜圖，從所得圖譜的結(jié)果可以得出對(duì)乙酰氨基酚及內(nèi)標(biāo)的峰形良好，對(duì)乙酰氨基酚及內(nèi)標(biāo)的分析不受基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。對(duì)乙酰氨基酚的出峰時(shí)間為0.95min，內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間為0.93min。

圖1 4-Acetamidophenol標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 4-Acetamidophenol雙空白樣品圖譜

圖3 4-Acetamidophenol單空白樣品圖譜

圖4 4-Acetamidophenol定量下限樣品譜圖

2.2 準(zhǔn)確度和精密度 準(zhǔn)確度和精密度主要根據(jù)LLOQ、LQC、GMQC、MQC、HQC濃度水平的質(zhì)控樣品來(lái)進(jìn)行評(píng)估。依據(jù)法規(guī)要求，各濃度水平QC樣品平均值的偏差百分比（DEV%）不得超過(guò)±15%（LLOQ不得超過(guò)±20%），變異系數(shù)（CV%）不得超過(guò)15.0%（LLOQ不得超過(guò)±20%）。

從表1試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看10μL樣品處理量方法下，超過(guò)2/3的質(zhì)控樣品滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，且每個(gè)濃度都有超過(guò)50%的樣品滿足接受標(biāo)準(zhǔn)。因此，該方法的分析結(jié)果滿足法規(guī)要求。

表1 分析物4-Acetamidophenol質(zhì)控樣品的DEV%與CV%

2.3 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)考察了該處理方法下，低濃度和高濃度水平下基質(zhì)對(duì)化合物和內(nèi)標(biāo)的影響?；|(zhì)效應(yīng)因子（MF），是用每個(gè)批次的空白基質(zhì)提取后加上中間溶液得到的樣品中分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積，除以相應(yīng)濃度的純?nèi)芤簶悠分蟹治鑫锖蛢?nèi)標(biāo)峰面積，計(jì)算得出。內(nèi)標(biāo)歸一化的MF由分析物的MF除以內(nèi)標(biāo)的MF得到。從表2、3、4的結(jié)果可以看出，該方法下內(nèi)標(biāo)歸一化的MF的變異系數(shù)均在8.2%以內(nèi)，滿足接受標(biāo)準(zhǔn)（內(nèi)標(biāo)歸一化變異系數(shù)不大于15%）。該方法下化合物及內(nèi)標(biāo)沒(méi)有明顯的基質(zhì)效應(yīng)影響。

表2 分析物4-Acetamidophenol的基質(zhì)效應(yīng)

2.4 回收率從表5和表6的結(jié)果可知低濃度和高濃度水平的質(zhì)控樣品中，分析物在每個(gè)濃度水平以及所有低高濃度水平的提取回收率的變異系數(shù)均在8.0%以下，內(nèi)標(biāo)的提取回收率的變異系數(shù)均在12.1%以內(nèi)，滿足變異系數(shù)在15%以內(nèi)的要求。因此該處理方法下，化合物和內(nèi)標(biāo)的回收率均滿足GLP法規(guī)下的要求。

表3 內(nèi)標(biāo)Acetamidophenol-d4的基質(zhì)效應(yīng)

表4 內(nèi)標(biāo)Acetamidophenol-d4歸一化基質(zhì)效應(yīng)

表5 分析物4-Acetamidophenol回收率

2.5 稀釋效應(yīng)另外試驗(yàn)測(cè)試了DQC樣品在20倍稀釋下的稀釋效應(yīng)，10μL的樣品處理方法中三個(gè)重復(fù)樣品之間的變異系數(shù)為4.0，所有稀釋樣品的濃度與理論濃度之間的偏差均在±4.8%以內(nèi)，滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，因此該方法在稀釋效應(yīng)方面滿足GLP法規(guī)要求（見(jiàn)表7）。

表7 分析物4-Acetamidophenol 稀釋效應(yīng)

2.6 討 論生物分析的樣品大多來(lái)源于各種動(dòng)物的血漿、血清或全血，也包括糞便其它體液。因此，動(dòng)物福利是生物分析需要考慮的一個(gè)因素。動(dòng)物福利要求，在動(dòng)物飼養(yǎng)和給藥采集樣品期間，要讓動(dòng)物很好的適應(yīng)所處的環(huán)境，并采取一些措施來(lái)滿足試驗(yàn)動(dòng)物基本的自然需求。從動(dòng)物福利角度來(lái)考慮，血液采集時(shí)嚴(yán)格按照體重的比例來(lái)采集，而我們通常的試驗(yàn)中會(huì)經(jīng)常用到大鼠。一般樣品分析需要處理30μL的樣品，由于大鼠等小型動(dòng)物采樣量有限，為了滿足多時(shí)間點(diǎn)采樣的要求，不得不需要更多的試驗(yàn)動(dòng)物，來(lái)進(jìn)行交叉采樣，這就增加了動(dòng)物個(gè)體之間的差異對(duì)PK數(shù)據(jù)的影響。而如果將30μL的樣品處理量降至10μL，一只動(dòng)物就能滿足整個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中各時(shí)間點(diǎn)采樣的要求，不僅可以減少試驗(yàn)動(dòng)物的使用量，采血量，減少動(dòng)物之間的差異對(duì)PK數(shù)據(jù)分析準(zhǔn)確性的影響，還可以滿足動(dòng)物福利的法規(guī)要求。

從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，不管是從待分析物還是內(nèi)標(biāo)來(lái)看，該方式下內(nèi)標(biāo)及待分析物之間的基質(zhì)效應(yīng)還是回收率均滿足GLP法規(guī)的要求。另外，稀釋效應(yīng)也均滿足GLP法規(guī)要求。因此從整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，微量取樣的數(shù)據(jù)是可靠的，微量取樣也可以滿足各方面的要求。因此，微量大鼠血漿中定量檢測(cè)對(duì)乙酰氨基酚的LC/MS/MS方法成功構(gòu)建，也是可行的。