鹽度驟變對金錢魚幼魚抗氧化狀態(tài)的影響

孫雪娜，馮廣朋，3，劉鑒毅，3，王 妤，莊 平，3，余焱方，鄒 雄

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與長江口漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，上海 200090）

金錢魚（Scatophagus argus）俗稱金鼓魚，隸屬于鱸形目（Perciformes），金錢魚科（Scatophagidae），金錢魚屬，主要分布于我國的東海南部、南海和北部灣地區(qū)［1］。金錢魚既可食用又可作為觀賞魚，經(jīng)濟(jì)價值很高，是南方沿海池塘單養(yǎng)和網(wǎng)箱套養(yǎng)的重要種類［2］。金錢魚幼魚在鹽度5～20范圍內(nèi)生長較快，但經(jīng)馴化在鹽度0～35范圍內(nèi)均可存活［3-4］，有望推廣到低鹽度的咸淡水水域和高鹽度的鹽堿水水域養(yǎng)殖，有較好的養(yǎng)殖前景。

鹽度是影響魚類生長、代謝及各種生理活動的重要因子［5-6］，也是影響推廣養(yǎng)殖的重要因素之一。近年來的研究表明，環(huán)境鹽度變化可能造成魚體抗氧化防御系統(tǒng)受損而引起氧化應(yīng)激［7-10］。氧化應(yīng)激產(chǎn)生過多的氧自由基會攻擊生物膜、蛋白質(zhì)和核酸，造成細(xì)胞質(zhì)外流、酶失活、遺傳復(fù)制錯誤等氧化損傷，進(jìn)而擾亂魚類正常的生理和行為活動［11］。魚體中的抗氧化系統(tǒng)可抵御氧化損傷。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）是抗氧化系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）是非常重要的非酶促成分［12-13］。SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，通過歧化作用分解超氧陰離子自由基，SOD清除·后產(chǎn)生H2O2，CAT能將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，使機(jī)體免受H2O2的毒害［14］。GSH作為一種抗氧化劑，可以參與消除有毒過氧化物［13］。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是脂質(zhì)過氧化物，可以間接反映組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的程度［15］。以上均為研究中常用的抗氧化指標(biāo)。

金錢魚在推廣養(yǎng)殖過程中，多會經(jīng)歷鹽度的馴化，但目前國內(nèi)外對金錢魚急性耐鹽性和抗氧化應(yīng)激方面的研究較少見，因此本研究以金錢魚幼魚為研究對象，開展鹽度驟升和驟降實(shí)驗(yàn)，研究不同組織在抗氧化方面應(yīng)對鹽度驟變時的生理應(yīng)答，旨在分析鹽度變化對其抗氧化狀態(tài)的影響，指導(dǎo)鹽度馴化和養(yǎng)殖等過程，為金錢魚規(guī)?；B(yǎng)殖推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚與養(yǎng)殖設(shè)計(jì)

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在東海水產(chǎn)研究所福鼎科研基地進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)用魚為東海水產(chǎn)研究所海南瓊海實(shí)驗(yàn)基地人工繁育的金錢魚幼魚，平均體長為（4.70±0.86）cm，平均體質(zhì)量為（6.27±0.28）g，暫養(yǎng)30 d。暫養(yǎng)期間水溫為（22±0.5）℃，鹽度20（當(dāng)?shù)刈匀缓Ｋ}度），24 h充氣泵充氧。每天8∶00和17∶00飽食投喂“正大”牌浮性配合飼料（粗蛋白≥30%，粗脂肪≥3%，粗灰分≤14%，水分≤12%，粗纖維≤14%，總磷≥0.8%，賴氨酸≥1.43%），每3 d換水2／3，吸去底部污物并清理殘餌。暫養(yǎng)結(jié)束后挑選健康無病的金錢魚幼魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

鹽度梯度設(shè)為5、20和35，以鹽度20暫養(yǎng)海水為對照組，每個鹽度梯度設(shè)置3個平行，每個平行隨機(jī)放入30尾魚。鹽度35的實(shí)驗(yàn)用水由當(dāng)?shù)睾Ｋc海水晶配制而成，鹽度5的實(shí)驗(yàn)用水由自然海水和淡水按比例配制而成，充分曝氣并用鹽度計(jì)進(jìn)行校正，穩(wěn)定48 h后使用。實(shí)驗(yàn)容器采用體積為300 L的圓塑料桶。實(shí)驗(yàn)開始時，隨機(jī)從暫養(yǎng)群體中撈取個體直接放入各鹽度組（含對照組）水體中。實(shí)驗(yàn)期間管理同暫養(yǎng)時一致。

1.2 取樣和檢測方法

從試驗(yàn)魚放入各試驗(yàn)組水體作為起始0 h并開始計(jì)時，在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、96 h、7 d時，從各鹽度梯度組中分別取樣，每個平行每次取3尾魚，置于冰盤內(nèi)解剖，取其肝臟、鰓和肌肉，組織樣品先用剪刀剪碎，準(zhǔn)確稱取0.2 g于玻璃勻漿管中，按質(zhì)量與體積比1∶9加入生理鹽水，于冰水浴下勻漿，以2500 r·min-1離心10 min后取上清，然后分別稀釋至所需濃度后進(jìn)行SOD、CAT酶活力和GSH、MDA含量的測定。其中，蛋白含量采用考馬斯亮蘭法測定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。SOD活力采用黃嘌呤氧化酶法測定，在波長為550 nm處比色測定吸光度值計(jì)算其活力，活力單位定義為：每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位（U·mgprot-1）。CAT活力通過405 nm波長下測定H2O2減少的量測定，活力單位定義為：每毫克組織蛋白每秒分解1μmoL的H2O2的量為1個CAT活力單位（U·mgprot-1）。SOD、CAT酶活力和GSH、MDA含量均按照說明采用南京建成試劑盒檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，各組數(shù)據(jù)通過SPSS 24.0軟件處理分析，利用單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan's檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性差異分析和多重比較，P＜0.05表明差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度驟變對幼魚行為和成活率的影響

鹽度驟變后，鹽度5和35組的金錢魚幼魚最初表現(xiàn)出貼壁狂游、鰓蓋煽動頻率加快、攝食量減少等一些應(yīng)激行為。在鹽度處理7 d內(nèi)，金錢魚幼魚的存活率為100%。

2.2 鹽度驟變對幼魚肝臟抗氧化狀態(tài)的影響

由圖1-A所見，SOD活力鹽度5組在12 h時較初始值顯著下降（P＜0.05），后于48 h升至最高，顯著高于初始值（P＜0.05），48 h～7 d期間，SOD活力逐步下降并趨于穩(wěn)定。SOD活力鹽度35組在12 h內(nèi)顯著下降（P＜0.05），此后逐漸升高，7 d時顯著高于其他各時間值（P＜0.05）。對于相同處理時間的不同鹽度組：在6～24 h期間，低鹽組和高鹽組SOD活力均顯著低于對照組（P＜0.05），48 h時各鹽度組差異不顯著，之后鹽度35組SOD活力上升，7 d時，SOD活力顯著高于對照組（P＜0.05）。

如圖1-B，CAT活力在鹽度5和35組中均呈先下降后升高的趨勢，12 h時最低，顯著低于12 h后的各時間點(diǎn)（P＜0.05）。鹽度5組CAT活力12 h后逐漸升高，并趨于穩(wěn)定，7 d時與初始水平一致。鹽度35組CAT活力在12 h后逐漸升高，在7 d時達(dá)到最高（P＜0.05）。對于相同處理時間的不同鹽度組：12 h時，低鹽和高鹽組CAT活力均顯著低于對照組（P＜0.05）；7 d時，鹽度35組酶活力顯著高于對照組（P＜0.05）。

GSH含量在兩處理組肝臟中均經(jīng)歷兩次先升高后降低的變化趨勢（圖1-C），均于6 h達(dá)到最大值，顯著高于處理前水平（P＜0.05），并分別于96 h和24 h時達(dá)到最小值，較處理前水平無顯著差異（P＞0.05）。對于相同處理時間的不同鹽度組：24 h時，鹽度35組GSH含量顯著低于對照組（P＜0.05）；除24 h外，鹽度處理組與對照組間無顯著差異（P＞0.05）。

如圖1-D，MDA含量鹽度5組肝臟中先升高后降低，最后趨于穩(wěn)定，12 h時含量最高，較處理前水平差異不顯著（P＞0.05）。鹽度35組MDA含量于12 h時顯著高于處理前（P＜0.05），隨后降低再升高，7 d時，MDA含量仍顯著高于處理前水平（P＜0.05）。對于相同處理時間的不同鹽度組：鹽度35組在12 h和96 h時，MDA含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖1 鹽度驟變對金錢魚幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of abrupt salinity changes on antioxidant indexes in liver of juvenile S.argus

2.3 鹽度驟變對幼魚鰓抗氧化狀態(tài)的影響

如圖2-A所示，鰓中SOD活力兩脅迫組變化趨勢一致，均呈先升高后降低最后保持平穩(wěn)的趨勢。鹽度5和35組SOD活力分別于12 h和24 h時最高，均顯著高于處理前水平（P＜0.05），隨后下降，7 d時與處理前水平一致。比較相同處理時間的不同鹽度組：鹽度5組在6 h、12 h、24 h和48 h時，SOD活力顯著高于對照組（P＜0.05）；鹽度35組在12 h、24 h時顯著高于對照組（P＜0.05）。

鰓中CAT活力在鹽度5和35組中均呈先升高后降低再保持平緩的趨勢（圖2-B）。鹽度5和35組，均在12 h時出現(xiàn)峰值，顯著高于初始水平（P＜0.05），隨后逐漸降低。鹽度5組CAT活力于48 h后保持平穩(wěn)狀態(tài)，且顯著低于初始水平（P＜0.05）。鹽度35處理組CAT活力于24 h后與初始水平一致。比較相同處理時間的不同鹽度組：鹽度5組除了在6 h和12 h時CAT活力顯著高于對照組外（P＜0.05），其余時間點(diǎn)較對照組無顯著差異（P＞0.05）；鹽度35組在6 h、12 h和48 h時，CAT活力顯著高于對照組（P＜0.05）。

鰓中GSH含量在鹽度5和35組隨時間呈先升高后降低的趨勢（圖2-C）。鹽度35和鹽度5組GSH含量先后于6 h和12 h時達(dá)到最大值，且顯著高于初始值（P＜0.05）。比較相同處理時間的不同鹽度組：12 h時，鹽度5組GSH含量顯著高于對照組（P＜0.05）；96 h時，鹽度35組GSH含量顯著低于對照組（P＜0.05）。

如圖2-D，鰓中MDA含量兩鹽度處理組在12 h時達(dá)到各自組中的峰值，顯著高于處理前（P＜0.05）。鹽度5組，MDA含量在12 h后降低，7 d時已降至處理前水平。鹽度35組，MDA含量在12 h后波動降低，但7 d時仍顯著高于處理前（P＜0.05）。比較相同處理時間的不同鹽度組：12 h和96 h時，鹽度35組MDA含量顯著高于對照組和鹽度5組（P＜0.05）；7 d時各組間差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 鹽度驟變對金錢魚幼魚鰓抗氧化指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of abrupt salinity changes on antioxidant indexes in gill of juvenile S.argus

2.4 鹽度驟變對幼魚肌肉抗氧化狀態(tài)的影響

肌肉SOD活力隨時間的變化趨勢與鰓中相似，鹽度驟變后，酶活力值先升高后降低再保持平穩(wěn)水平（圖3-A）。鹽度5和35組，SOD活力分別于6 h和12 h時，顯著高于其他各時間點(diǎn)對應(yīng)的酶活力值（P＜0.05）。對于相同處理時間的不同鹽度組：6 h、12 h時，鹽度5組SOD活力顯著高于對照組（P＜0.05）；6 h、12 h、24 h時，鹽度35組SOD活力顯著高于對照組（P＜0.05），但在48 h時顯著低于對照組（P＜0.05）；7 d時各鹽度組間無顯著差異（P＞0.05）。

如圖3-B，肌肉中CAT活力鹽度5組在7 d內(nèi)各時間段均無顯著性差異（P＞0.05）。鹽度35組中CAT活力6 h和12 h時顯著低于其余各值（P＜0.05），12 h后CAT活力波動上升至初始水平。對于相同處理時間的不同鹽度組：僅在6 h和12 h時，鹽度35處理組CAT活力顯著低于對照組（P＜0.05）；其余時間點(diǎn)各鹽度組間無顯著差異（P＞0.05）。

隨著處理時間的延長，肌肉中GSH含量在鹽度5組中先平緩上升后平緩下降（圖3-C），12 h時最高，顯著高于處理前（P＜0.05），96 h和7 d時顯著低于處理前（P＜0.05）。鹽度35組在12～24 h期間升至最高，之后逐漸下降至處理前水平。相同處理時間的不同鹽度組均無顯著差異（P＞0.05）。

肌肉中MDA含量在鹽度5和35組中，經(jīng)波動起伏后均恢復(fù)至處理前水平（圖3-D），同一鹽度條件下各時間段的MDA含量均無顯著差異（P＞0.05）。相同處理時間下的不同鹽度組間均無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 鹽度驟變對金錢魚幼魚肌肉抗氧化指標(biāo)的影響Fig.3 Effect of abrupt salinity changes on antioxidant indexes in muscle of juvenile S.argus

3 討論

3.1 鹽度驟變對幼魚行為和成活率的影響

金錢魚屬廣鹽性魚類，可在海水、淡咸水中生長發(fā)育，甚至經(jīng)馴化后能在淡水中生存［16-17］。本研究表明，鹽度突然升高或降低對金錢魚幼魚行為和成活的影響較小，鹽度驟變7 d內(nèi)無死亡情況，說明金錢魚幼魚對于急性鹽度變化有較強(qiáng)的適應(yīng)性，有利于鹽度馴化。

3.2 鹽度驟變對幼魚肝臟抗氧化狀態(tài)的影響

肝臟是機(jī)體對外界刺激反應(yīng)最早、最敏感的器官之一，也是進(jìn)行氧化反應(yīng)較多的器官［18-19］。與花鱸（Lateolabrax maculatus）［15］、點(diǎn)帶石斑魚（Epinephelus malabaricus）［20］和點(diǎn)籃子魚（Siganus guttatus）［5］等眾多魚類中的研究結(jié)果一致，本研究中，金錢魚幼魚肝臟中抗氧化酶活力和GSH含量最高，肝臟是金錢魚抗氧化防御的主要器官。

本研究中，鹽度驟升和驟降后，金錢魚幼魚肝臟中的SOD和CAT活力先降低，隨時間延長酶活力恢復(fù)，然后逐漸升高，這與云紋石斑魚（Epinehelus moara）［21］、暗 紋 東 方 鲀（Takifugu obscurus）［22］和 海 洋 青 鳉 魚（Oryzias melastigma）［23］中的研究結(jié)果一致。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是鹽度15的波動幅度引起肝臟強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，抑制了SOD和CAT活性，隨后活力升高以清除過多的活性氧自由基。GSH含量在以上兩種抗氧化酶活力降低的同時補(bǔ)償性增長以清除機(jī)體內(nèi)多余的活性氧自由基，雖在7 d時恢復(fù)至對照組水平，但期間波動起伏較多，可能是GSH與多種抗氧化酶進(jìn)行反應(yīng)的結(jié)果［24］。在SOD和CAT活力較低時MDA含量較高，可能是由于抗氧化酶活性受到抑制，MDA含量累積，隨著酶活力升高，MDA含量有所降低。7 d時，鹽度驟降組肝臟中SOD、CAT、GSH與MDA水平均與對照組一致，說明此時抗氧化系統(tǒng)已經(jīng)適應(yīng)了鹽度降低的變化。在革胡子鲇（Claries lazera）［25］的研究中發(fā)現(xiàn)，隨鹽度驟變時間的延長，肝臟中SOD、CAT活力和MDA含量有逐漸升高的趨勢。與該結(jié)果相似，在本研究的高鹽組中，7 d時SOD和CAT活力與MDA含量仍保持較高水平，這可能是因?yàn)榻疱X魚幼魚肝臟對鹽度驟升產(chǎn)生的氧化應(yīng)激壓力大，適應(yīng)過程較長。

3.3 鹽度驟變對幼魚鰓抗氧化狀態(tài)的影響

鰓是魚類滲透壓調(diào)節(jié)的關(guān)鍵器官，對離子的調(diào)節(jié)具有重要作用［5］。在鹽度發(fā)生變化時，鰓不僅要及時進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，還承受了一定的氧化應(yīng)激壓力。胡靜等［26］研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽度的降低，鰓絲的CAT活性在最初階段呈上升趨勢，前48 h內(nèi)CAT活性較強(qiáng)，96 h時基本恢復(fù)至對照組水平。GHANAVATINASAB等［27］發(fā)現(xiàn)，將黃鰭棘鯛（Acanthopagrus sheim）由鹽度20轉(zhuǎn)入鹽度5、12和34的環(huán)境中，14 d后，鰓中CAT、SOD、GPx和MDA水平在各組間均無顯著性差異。本研究結(jié)果與以上結(jié)果相似，當(dāng)鹽度驟升和驟降時，金錢魚幼魚鰓中SOD、CAT和GSH為清除自由基，出現(xiàn)了水平先升高后降低的趨勢，最終7 d時又恢復(fù)至與對照組相似的水平。鹽度5組鰓MDA含量經(jīng)歷了一定程度的先升高，后下降至對照組水平，說明鹽度降低條件下，金錢魚幼魚鰓組織可以抵御氧化應(yīng)激，較快地恢復(fù)正常。本研究發(fā)現(xiàn)，鰓組織應(yīng)對鹽度驟變產(chǎn)生的氧化應(yīng)激時表現(xiàn)與肝臟不同，推測不同組織受氧化應(yīng)激程度不同，抵御策略也存在差異。

3.4 鹽度驟變對幼魚肌肉抗氧化狀態(tài)的影響

肌肉在魚體中分布廣、比重大，對其進(jìn)行抗氧化酶活性的測定也可以反映出魚體對環(huán)境的抗氧 化 應(yīng) 激 情 況［28］。趙 峰 等［29］在 施 氏 鱘（Acipenser schrenckii）的研究中認(rèn)為，肌肉屬于滲透壓感知的敏感組織，在鹽度發(fā)生變化時能夠積極響應(yīng)。在軍曹魚（Rachycentron canadum）［28］中，肌肉SOD和CAT活力均隨著鹽度的降低而增高。與以上研究結(jié)果不完全相同的是，鹽度突然升高和降低后，金錢魚幼魚肌肉SOD活力先升高后降低再趨于平穩(wěn)。CAT活力在鹽度驟降后先升高后降低，最后保持與對照組一致的平穩(wěn)水平；在鹽度驟升后則先降低后上升，最終恢復(fù)至對照組水平。鹽度驟變條件下，SOD和CAT活力變化不一致的現(xiàn)象在點(diǎn)帶石斑魚［19］、黃姑魚（Nibea albiflora）［30］和 銀 鯧（Pampus argenteus）［31-32］肝臟中都觀察到類似情況，但目前有關(guān)鹽度驟變處理對魚類肌肉抗氧化酶影響的報道并不多，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因還需進(jìn)一步探討。鹽度驟變對金錢魚幼魚肌肉中GSH和MDA含量影響不大，推測是因?yàn)榧∪庵挟a(chǎn)生的氧化應(yīng)激較小。

4 小結(jié)

金錢魚幼魚在急性鹽度脅迫下有較強(qiáng)的適應(yīng)性，在鹽度20條件下，突然升高或降低15的鹽度梯度，存活率幾乎不受影響。鹽度驟變7 d后，肝臟、鰓和肌肉中的抗氧化狀態(tài)接近或恢復(fù)至處理前水平，適合馴養(yǎng)。與鹽度驟升相比，金錢魚幼魚在鹽度驟降時面臨的氧化壓力較小，恢復(fù)時間較快。本研究結(jié)果為金錢魚幼魚養(yǎng)殖過程中的鹽度馴化提供了一定指導(dǎo)，可供金錢魚的規(guī)?；B(yǎng)殖發(fā)展參考。