魚油酶法水解及酯交換反應中脂肪酶活力檢測方法的研究

江 洲，許曦锃，傅 紅*

(1.福建天馬科技集團股份有限公司，福建省特種水產(chǎn)配合飼料重點實驗室，福建 福清350308； 2.福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108)

脂肪酶是一種能夠催化中長碳鏈酯類的酯鍵發(fā)生斷裂與逆向合成的生物催化劑[1]，在油脂加工等領(lǐng)域應用前景廣闊。利用脂肪酶進行酶法酯交換反應以提高魚油甘油三酯原料的ω-3功能性脂肪酸含量，是近年來食品和飼料行業(yè)的研究熱點[2-6]。準確測定酶活力這一關(guān)鍵性指標，對脂肪酶在魚油產(chǎn)業(yè)上的應用具有重要意義。

目前，脂肪酶活力的檢測主要有酸堿滴定法、紫外分光光度法、氣相色譜分析法、界面張力法、濁度法、酶聯(lián)免疫吸附法等[7-12]，雖然酶活力檢測方法眾多，但每種方法的底物條件和操作條件各不相同，影響了結(jié)果的準確性和可比性。而且，商業(yè)化脂肪酶的酶活力檢測方法大多基于其水解反應活力，即檢測其水解相應底物的消耗量或者產(chǎn)物的生成量來表征酶活力大小。雖然理論上脂肪酶可以催化水解和酯化兩個可逆反應，但某些具有很高水解活性的脂肪酶在非水相中可能無法表現(xiàn)出同樣能力的合成活性[13]。魚油酯交換反應屬于非水相催化反應，水解酶活力可能不足以全面準確地反映其在非水相催化反應中的酶活力特性。因此，本研究選用8種商品化脂肪酶，通過對比酸堿滴定法、分光光度法、氣相色譜法等多種酶活力的傳統(tǒng)檢測方法，選擇適用于水解和酯交換兩種反應體系的酶活力檢測方法，并分別應用于魚油酶法水解和酯交換反應體系，為高酶活脂肪酶在魚油工業(yè)中的應用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

游離脂肪酶L1、L2、L3、L4：福建百特生物科技有限公司；L5：豬胰脂酶，購于合肥博美生物技術(shù)有限公司；固定化酶L6、L7、L8分別是Novozyme 435、Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM，購于丹麥諾維信公司。魚油原料、魚油乙酯：福建天馬科技集團股份有限公司；薄層層析硅膠G為分析純：青島海洋化工有限公司；對硝基苯酚、對硝基苯酚棕櫚酸酯為分析純：麥克林生化科技有限公司；三油酸甘油酯、正辛酸等均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC7890A氣相色譜儀、112-88A7HP-88毛細管色譜柱：美國Agilent公司；T6-X紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；ZD-2自動電位滴定儀：上海精密科學儀器有限公司；HH-501超級恒溫水浴鍋、HJ-4A磁力攪拌器：上海方瑞儀器有限公司；FA25型高剪切分散乳化機：上海FLUKO公司；CF16RX-Ⅱ高速冷凍離心機：天美(中國)科學儀器有限公司；RE52-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 脂肪酶活力的測定

1.3.1 聚乙烯醇-橄欖油乳化法測定水解活力

通過聚乙烯醇和橄欖油的乳化體系，采用電位滴定法測定脂肪酶的水解活力[14]，一個水解活力單位(U)為脂肪酶1 min內(nèi)水解底物所釋放1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

1.3.2 對硝基苯酚法測定水解活力

以棕櫚酸對硝基苯酯(p-NPP)和水為底物、Tris-HCl為緩沖液，采用比色法測定脂肪酶水解產(chǎn)物對硝基苯酚含量[15]。一個水解活力單位(U)為脂肪酶1 min水解底物所釋放1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

1.3.3 正辛酸-三油酸甘油酯交換法測定酯交換活力

以三油酸甘油酯與正辛酸作為底物，在脂肪酶的催化下進行?；D(zhuǎn)移反應，將正辛酸置換到甘油酯的鏈上，采用氣相色譜分析法測定脂肪酶的酯交換活力[16]。一個酯交換活力單位(U)為脂肪酶1 min催化l μg正辛酸轉(zhuǎn)移到三油酸甘油酯中所需的酶量。

1.3.4 對硝基苯酚法測定酯交換活力

以棕櫚酸對硝基苯(p-NPP)和乙醇為底物，在脂肪酶的催化下進行酯交換反應，采用比色法測定產(chǎn)物對硝基苯酚含量[17]。一個酯交換活力單位(U)為脂肪酶1 min酯交換底物生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

1.4 酶促水解制備脂肪酸型魚油

將甘油三酯魚油與一定pH的磷酸緩沖溶液以2∶3的體積比混合，加入適量脂肪酶混合均勻，在酶的最適溫度和一定攪拌速度下水浴反應16 h。待反應結(jié)束后，萃取上層魚油，除去溶劑和水分，收集脂肪酸型魚油混合物，待測[18]。

1.5 脂肪酶催化魚油酯交換反應

將魚油甘油酯原料、魚油乙酯和適量脂肪酶在燒杯中混勻反應。加入丙酮終止反應，離心除酶，用薄層層析法分離出甘油三酯，經(jīng)正己烷萃取后甲酯化，利用氣相色譜儀測定TG型魚油中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)含量[19-20]。

脂肪酸組分的氣相色譜分析條件[21]：載氣為純氮氣，流速為1 mL/min，氫氣35 mL/min，空氣350 mL/min；進樣口溫度250°C，F(xiàn)ID檢測器280°C。程序升溫：140°C保持5 min，以4°C/min程序升溫到220°C持續(xù)保持35 min。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復測定3次，利用SPSS 19軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P<0.05表明存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶水解活力檢測方法的選擇

8種商業(yè)化脂肪酶的產(chǎn)品包裝上原標識酶活如表1所示。采用聚乙烯醇-橄欖油乳化法測得的脂肪酶水解活力如圖1所示。結(jié)果表明，以橄欖油作為底物，游離脂肪酶中的L1、L3、L5的水解活力比較高，其中水解活力最高的是L5豬胰脂酶，達到97 500 U/g。固定化脂肪酶中，L8的水解活力為90 667 U/g，遠遠高于L6和L7的水解活力。

注：L1代表游離脂肪酶1；L2代表游離脂肪酶2；L3代表游離脂肪酶3；L4代表游離脂肪酶4；L5代表豬胰脂酶；L6代表Novozyme 435；L7代表Lipozyme TL IM；L8代表Lipozyme RM IM。下同。

Notes：L1～L4 represented the free lipase 1～the free lipase 4，respectively；L5 represented porcine pancreatic lipase；L6 represented Novozyme 435；L7 represented Lipozyme TL IM；L8 represented Lipozyme RM IM.The same as below.

對硝基苯酚法測得的脂肪酶水解活力如圖2所示。結(jié)果顯示，游離脂肪酶L2、L3、L5的水解活力較高，L4最低；而固定化脂肪酶中L8為522 U/g，高于L6和L7，這與聚乙烯醇-橄欖油乳化法測得的總體趨勢相似。但是，對硝基苯酚法測得水解活力最高的是L2，為34 942 U/g，與聚乙烯醇-橄欖油乳化法存在偏差。

聚乙烯醇-橄欖油乳化法和對硝基苯酚法兩種方法的實測水解酶活力相對標準偏差值(RSD)，如表1所示。從結(jié)果看出，聚乙烯醇-橄欖油乳化法的相對標準偏差基本在10%以下，顯著小于對硝基苯酚法。這可能是在橄欖油乳化體系中采用的均質(zhì)乳化提高了酶與底物相互作用的表面積，使脂肪酶充分接觸油水界面，促進滴定結(jié)果較穩(wěn)定，相對標準偏差較小。另一方面，從反應的底物特征看，和棕櫚酸對硝基苯相比，橄欖油與魚油水解和酯交換反應的原料天然魚油甘油三酯的分子結(jié)構(gòu)更接近，能夠更準確地反映酶法反應中的底物特征。因此，聚乙烯醇-橄欖油乳化法更適用于篩選魚油水解反應所需的高酶活特性所需的脂肪酶。

表1 不同方法測得脂肪酶水解活力和酯交換活力的相對標準偏差(RSD)

2.2 脂肪酶酯交換活力檢測方法的選擇

正辛酸-三油酸甘油酯交換法測定酯交換活力法是通過脂肪酶在非水相體系中酶促酯交換，使正辛酸和三油酸甘油酯發(fā)生酰基轉(zhuǎn)移，通過氣相色譜分析甘油酯中正辛酸的結(jié)合率反映酯交換活力[14]。該法測得8種脂肪酶的酯交換活力如圖3所示。結(jié)果顯示，固定化脂肪酶L6、L7、L8的酯交換活力高，L7和L8分別達到32 663 U/g 和19 933 U/g，但是游離脂肪酶的酯交換活力都較低，其中L1的酯交換活力高于其他游離脂肪酶。

對硝基苯酚法測得8種脂肪酶的酯交換活力，如圖4所示。結(jié)果顯示較高的是固定化脂肪酶L8和L6，分別為8.10 U/g和3.92 U/g，其他脂肪酶的酯交換活力都較低。

正辛酸-三油酸甘油酯交換法和對硝基苯酚法兩種方法測得的酯交換脂肪酶的酶活力值存在差異，但主要與實驗方法有關(guān)。酯交換反應基于不同的反應底物和類型，正辛酸-三油酸甘油酯交換法是脂肪酸與甘油酯類的?；粨Q反應，對硝基苯酚法是醇與酯類的?；D(zhuǎn)移反應，在酶活力的檢測應用上，正辛酸-三油酸甘油酯交換法顯然更接近于魚油的酯交換反應底物特征，并且此法中的薄層層析法除酸效果好，不易影響氣相色譜對辛酸結(jié)合率的測定，使得靈敏度高，結(jié)果較為準確；而對硝基苯酚法雖然操作簡便，但萃取時間較長，目標產(chǎn)物易分解，這也導致了正辛酸-三油酸甘油酯交換法相對標準偏差遠遠小于對硝基苯酚法(表1)。

2.3 脂肪酶的水解和酯交換活力的相關(guān)性

對比上述幾種脂肪酶活力的測定方法，確定了脂肪酶水解活力的測定采用聚乙烯醇-橄欖油乳化法，酯交換活力的測定采用正辛酸-三油酸甘油酯交換法。將兩種脂肪酶活力值用多種相關(guān)數(shù)學模型進行兩兩擬合，探究其水解活力(x)和酯交換活力(y)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其線性模型擬合方程為y=-0.083 5x+ 17 065.6，相關(guān)系數(shù)R2為0.071 5；冪指數(shù)擬合模型y=48 957.1x-0.156，相關(guān)系數(shù)R2為0.151 3；指數(shù)函數(shù)的單指數(shù)衰減擬合模型y=8 192.1+16 418.4e(-x/2 223)，相關(guān)系數(shù)R2為0.204 0。上述擬合曲線方程及相關(guān)系數(shù)顯示，酯交換活力大致隨水解活力的增大而減小，總體近似于負相關(guān)關(guān)系。這和Wu X Y等[22]在催化酯合成中發(fā)現(xiàn)脂肪酶粗酶液的水解活性和酯化活性相關(guān)系數(shù)較小的結(jié)果相一致。因此，在脂肪酶活力實際測定時，水解活力不能反映酯交換活力，兩者之間不能相互預測，實踐中需要對兩種酶活力逐一測定。

2.4 脂肪酶在脂肪酸型及酯交換型魚油產(chǎn)品中的應用

選擇3種高水解活力的脂肪酶L1、L3、L5，利用酶促水解甘油三酯型精制魚油制備脂肪酸型魚油產(chǎn)品，其中原料魚油甘油酯的酸價為4.43 mg KOH/g；另選3種酯交換活力較高的脂肪酶L6、L7、L8，制備脂肪酸甘油三酯型魚油產(chǎn)品，反應原料是甘油三酯型原料魚油和乙酯型精制魚油，兩者的EPA和DHA的總含量分別為29.5%和71.5%。從表2中可以看出，三種脂肪酸型魚油的酸價是水解前的25～30倍，其中L5脂肪酶水解魚油產(chǎn)物酸價達到137.61 mg KOH/g；魚油酯交換產(chǎn)物甘油三酯中EPA和DHA含量大大提高，其中固定化酶L8的富集效果最好，EPA和DHA總含量為55.38%，比原料魚油提高了26%。上述魚油產(chǎn)品中脂肪酶水解活力和酯交換活力的次序能夠和圖1、圖3結(jié)果相對應，說明聚乙烯醇-橄欖油乳化法和正辛酸-三油酸甘油酯交換法分別適合于篩選魚油水解和酯交換反應所需的脂肪酶。

表2 脂肪酸型及酯交換型魚油產(chǎn)品應用

3 結(jié)論

以8種商品化脂肪酶為原料，研究適合于魚油水解反應和酯交換反應的脂肪酶及其酶活檢測方法，統(tǒng)一酶活力單位為U/g。通過對比聚乙烯醇-橄欖油乳化法和對硝基苯酚法測定脂肪酶的水解活力的相對標準偏差值可知，聚乙烯醇-橄欖油乳化法更適合于篩選魚油水解反應所需的高酶活的脂肪酶。通過對比正辛酸-三油酸甘油酯交換法和對硝基苯酚法測定脂肪酶酯交換活力的相對標準偏差值可知，正辛酸-三油酸甘油酯交換法更適合于篩選魚油酯交換反應所需的脂肪酶。一元一次線性模型、冪指數(shù)擬合模型和指數(shù)函數(shù)模型擬合顯示，水解酶活和酯交換酶活的相關(guān)系數(shù)值R2在0.07～0.20之間，兩者無顯著性相關(guān)，表明脂肪酶水解活力不能反映酯交換活力；聚乙烯醇-橄欖油乳化法和正辛酸-三油酸甘油酯交換法兩種酶活檢測方法分別應用于魚油水解和酯交換反應脂肪酶的效果良好。