醒腦靜注射液對(duì)大鼠腦缺血急性期半暗帶轉(zhuǎn)化的影響

孫逸坤，吳麗君，李媛媛，劉浩琦，安 娜，宋 珂，張 華，高永紅

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病研究院，北京 100029；3.河南省開封市尉氏縣中醫(yī)院，河南開封 475500）

缺血性中風(fēng)是由于流向大腦的腦血流減少或阻塞而引起腦組織急性損傷的一種腦血管疾病，約占所有中風(fēng)疾病的87%，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率等特點(diǎn)，是目前世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一［1，2］。目前臨床上治療缺血性中風(fēng)的唯一安全有效的療法是溶栓治療，但是由于嚴(yán)格的時(shí)間窗限制和溶栓后出血性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)，只有不到4%的中風(fēng)患者可從中受益，臨床應(yīng)用受到很大的限制［3］。

局灶性腦缺血發(fā)生后，受損傷的腦組織由缺血核心區(qū)和缺血半暗帶區(qū)兩部分組成。缺血核心區(qū)由于壞死細(xì)胞死亡而遭受不可逆的神經(jīng)元損傷，而缺血半暗帶區(qū)旁系小血管的殘血流量可減緩細(xì)胞的死亡速度，尚存在可挽救和代謝活躍的細(xì)胞［2，4，5］。因此挽救半暗帶區(qū)可逆性損傷神經(jīng)元是腦缺血急性期治療的關(guān)鍵。

醒腦靜注射液是以古方安宮牛黃丸為基礎(chǔ)研發(fā)，由麝香、冰片、梔子、郁金等中藥組成的水溶性注射液［6］。醒腦靜注射液對(duì)缺血性中風(fēng)急性期患者有明確的臨床療效，可透過(guò)血腦屏障改善局部腦缺血現(xiàn)象，干預(yù)半暗帶區(qū)發(fā)生的病理生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，起到缺血后神經(jīng)保護(hù)作用［7］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究醒腦靜注射液對(duì)大鼠腦缺血急性期半暗帶轉(zhuǎn)化的影響，為醒腦靜注射液治療缺血性中風(fēng)提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SFP 級(jí)健康雄性SD 大鼠，體重（270±10）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SYXK（京）2012-0024。在適宜的溫度和濕度條件下，大鼠采取分籠飼養(yǎng)方式，自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審核（倫理編號(hào)：15-05）。

1.2 藥物及試劑

醒腦靜注射液（10 mL/支，由麝香、冰片、梔子、郁金四種成分組成），無(wú)錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司，貨號(hào)151107；TUNEL 染色試劑盒（Roche）；DAB 顯色液（北京中杉金橋生物科技有限公司）；焦油紫（Sigma，C5042）。

1.3 儀器

7.0T Micro-MRI 成像系統(tǒng)（德國(guó)Bruker 公司）；透射電鏡（日本Hitachi 公司，H7650）；自動(dòng)脫水、包埋機(jī)、烤片機(jī)（Leica 公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus BX60 型）。

1.4 造模、分組及給藥

采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型：在恒定濕度及22 ℃的室溫條件下，大鼠術(shù)前禁食不禁水12 h，3.5%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型［8］。假手術(shù)組只進(jìn)行血管分離術(shù)，不進(jìn)行線栓插入過(guò)程。術(shù)后將所有大鼠置于溫暖環(huán)境下，密切觀察生命體征變化，且蘇醒后不限制其活動(dòng)及飲食。參照mNSS 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［9］于大鼠清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，選取造模成功（7～12 分）的大鼠隨機(jī)分為模型組和醒腦靜組。各組大鼠均于術(shù)后2 h 進(jìn)行腹腔注射給藥，2次/d。其中醒腦靜組按0.18 mL/100 g 注射醒腦靜注射液，假手術(shù)組和模型組則給予同等劑量的生理鹽水。

1.5 灌流及取材方法

術(shù)后24 h，各組大鼠經(jīng)深度麻醉后仰臥位固定于解剖板上，迅速開胸，分離心包膜，暴露并游離出心臟，經(jīng)心尖部從左心室插入灌流針至主動(dòng)脈弓，固定并夾閉腹主動(dòng)脈，剪開右心耳，依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，灌注成功后迅速斷頭取腦浸泡于4%多聚甲醛溶液中。24 h 后經(jīng)常規(guī)脫水透明和石蠟包埋后連續(xù)冠狀切片，切片厚度4 μm，烘烤備用。

1.6 尼氏染色觀察大鼠半暗帶區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化

石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，依次放入二甲苯溶液和梯度乙醇中脫蠟至水；然后將切片浸入尼氏染色液（0.5% 焦油紫）37 ℃恒溫孵育10～20 min。蒸餾水快洗，0.25%冰醋酸酒精溶液分色，脫水、透明后，用樹脂膠進(jìn)行封片。每組3 只，每只大鼠選取一張切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察半暗帶區(qū)域神經(jīng)元形態(tài)組織變化并拍照。

1.7 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL 染色）

石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，按照TUNEL 染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，DAB 顯色，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，蘇木精復(fù)染，溫水反藍(lán)。脫水、透明、中性樹膠封片。每只大鼠選取一張切片，每組3 只，低倍鏡下定位缺血半暗帶區(qū)，高倍鏡下每張切片選取5 個(gè)不重疊視野，采用Image J 進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)并取其均值。

1.8 電鏡觀察半暗帶區(qū)超微結(jié)構(gòu)

造模成功后24 h，每組取3 只大鼠，用4%多聚甲醛和2%戊二醛PBS 溶液灌注成功后取出腦組織，于缺血側(cè)半暗帶區(qū)切取體積大小為1 mm3的腦組織塊，迅速放入4%戊二醛溶液中于4 ℃冰箱中固定2 h。PBS 清洗3 次后置于1%鋨酸溶液中固定2～3 h，PBS 再次清洗后進(jìn)行脫水、包埋，并在-80 ℃下聚合24 h。超薄切片機(jī)切取50～60 nm 厚度的超薄切片，經(jīng)醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色后，在透射電鏡下觀察半暗帶區(qū)神經(jīng)血管單元（Neurovascular unit，NVU）的改變。

1.9 磁共振檢測(cè)

大鼠造模成功后隨機(jī)分為模型組（n=5）和醒腦靜組（n=6），于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)（4.5、24 h）用7.0T Micro-MRI 成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，包括T1 加權(quán)像（T1 Weighted Image，T1WI）、T2 加權(quán)像（T2 Weighted Image，T2WI）、彌散加權(quán)成像（Diffusion Weighted Imaging，DWI）及灌注成像（perfusion-weighted imaging，PWI）。掃描參數(shù)設(shè)置如下：T1WI∶SE 序列，TR/TE=350 ms/11 ms，層厚1 mm，間隔0.3 mm，矩陣192×122；T2WI ：FSE 序列，TR/TE=3 140 ms/37 ms，層厚1 mm，間隔0.3 mm，矩陣320×240；擴(kuò)散加權(quán)成像（Diffusion weighted imaging，DWI）：TR/TE=4 500 ms/35 m，層厚1 mm，間隔0.3 mm，矩陣128×108；灌注加權(quán)成像（Perfusion weighted imaging，PWI）：EPI 序列，TR/TE=1 500 ms/19 ms，層厚0.9 mm，間隔0 mm，矩陣128×128。

1.10 數(shù)據(jù)分析

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 尼氏染色

圖1A（即假手術(shù)組）神經(jīng)元排列致密整齊，細(xì)胞數(shù)量飽滿，形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體清晰可見(jiàn)且分布均勻。圖1B（即模型組）神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，著色淺，胞體固縮凋亡，形態(tài)、結(jié)構(gòu)嚴(yán)重改變，細(xì)胞胞漿中尼氏小體輪廓模糊或消失。圖1C（即醒腦靜組）神經(jīng)元恢復(fù)較好，細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，凋亡神經(jīng)元數(shù)量明顯較少，細(xì)胞內(nèi)尼氏小體分布正常且形態(tài)規(guī)則。

圖1 MCAO 大鼠術(shù)后24 h 半暗帶區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化（尼氏染色，×400）Fig 1 Morphological changes of neurons in penumbra of MCAO rats 24 h after operation（Nissl staining，×400）

2.2 電鏡下觀察半暗帶區(qū)NVU 超微結(jié)構(gòu)變化

圖2A（即假手術(shù)組）神經(jīng)元形態(tài)正常，膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常且染色質(zhì)分布均勻；微血管無(wú)改變，管徑正常、管壁光滑，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)未見(jiàn)變化。圖2B（即模型組）神經(jīng)元細(xì)胞明顯固縮，胞核彌散且染色不均一，核仁邊聚；微血管出現(xiàn)不規(guī)則變形，管腔狹窄，血管周圍可見(jiàn)不同程度性溶解伴水腫；圖2C（即醒腦靜組）神經(jīng)元水腫減輕，胞核形態(tài)相對(duì)正常；微血管未見(jiàn)明顯變形，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)尚可，水腫較模型組減輕。

圖2 MCAO 大鼠術(shù)后24 h 神經(jīng)血管單元比較（透射電鏡，×7 000）Fig 2 Comparison of neurovascular units in MCAO rats 24 h after operation（TEM，×7 000）

2.3 TUNEL 染色

TUNEL 染色觀察大鼠缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡情況并統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，其中凋亡細(xì)胞呈棕色，細(xì)胞核深染。圖3A（即假手術(shù)組）可見(jiàn)少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，為正常生理表達(dá)。與假手術(shù)組（1.73±0.61）相比，模型組（20.13±0.46）TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.01），見(jiàn)圖3B；與模型組相比，醒腦靜組（14.27±0.81）TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）。見(jiàn)圖3C。

圖3 MCAO 大鼠術(shù)后24 h 細(xì)胞凋亡的病理學(xué)表現(xiàn)（TUNEL 染色，×400）Fig 3 Pathological changes of apoptosis in MCAO rats 24 h after operation（TUNEL staining，×400）

2.4 磁共振觀察半暗帶轉(zhuǎn)化結(jié)果

磁共振結(jié)果顯示，ADC 反映腦梗死面積，CBF反映腦血流情況，其中紅色表示血流通暢，藍(lán)黑色表示血流較少或中斷。圖4 結(jié)果顯示，醒腦靜組24 h 腦梗死面積小于模型組，且腦血流狀態(tài)亦明顯優(yōu)于模型組。半暗帶丟失率計(jì)算結(jié)果顯示，與模型組相比［（111.24±73.46）%］，醒腦靜組［（62.66±30.43）%］的半暗帶丟失率明顯降低（Z=-2.008，P=0.045）。

圖4 MCAO 大鼠MRI 示缺血演變過(guò)程圖Fig 4 Ischemic evolution map of MRI in MCAO rats

3 討論

腦缺血是一個(gè)從超急性期到急性期、亞急性期和慢性期的動(dòng)態(tài)過(guò)程，最大限度地降低發(fā)病到治療的時(shí)間是目前研究的重點(diǎn)［13］。急性腦梗死分為缺血核心區(qū)和半暗帶區(qū)，其中缺血核心區(qū)由于葡萄糖和氧氣的缺乏導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞因壞死而死亡，而核心區(qū)域周圍尚存在可挽救的、代謝活躍的神經(jīng)元細(xì)胞，被稱為缺血半暗帶區(qū)［14］。

缺血半暗帶一詞最早由Astrup 等提出，其是指電活動(dòng)終止但局部CBF 仍高于細(xì)胞離子梯度所需的閾值（10～18 mL/100 g/min），故能保持正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和離子平衡，為可逆性損傷［15-17］。隨后Sharp等［18］將半暗帶定義擴(kuò)展，提出“多分子半暗帶”的概念，即在正常腦組織和梗死中心區(qū)之間，不同時(shí)間內(nèi)多種基因在選擇性神經(jīng)元死亡區(qū)、蛋白質(zhì)變性區(qū)、低氧區(qū)和擴(kuò)散性抑制區(qū)的表達(dá)不同。半暗帶是一個(gè)時(shí)間依賴的概念，在缺血的早期階段，如果無(wú)法及時(shí)恢復(fù)血流，隨著時(shí)間的推移，半暗帶區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞將會(huì)發(fā)生不可逆的損害，半暗帶范圍亦隨之縮小。這種情況是由一系列復(fù)雜的生理和病理引起的，主要包括保護(hù)性三磷酸腺苷合成的減少；興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放的增加；一氧化氮和白介素-1 水平的升高以及水平升高的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、腫瘤壞死因子α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和缺氧誘導(dǎo)因子等［19］。缺血半暗帶理論是急性腦梗死臨床治療的基礎(chǔ)，所謂“時(shí)間就是大腦”中的大腦指的就是缺血半暗帶［20］，此處的神經(jīng)元細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)僅表現(xiàn)為生物電活動(dòng)等暫時(shí)停止，但細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能仍保存完整，如及時(shí)恢復(fù)血流或進(jìn)行腦保護(hù)則可挽救區(qū)域內(nèi)大量尚可存活的神經(jīng)元，使其恢復(fù)正?；蛘卟糠只謴?fù)正常，抑制或減緩缺血性腦梗死的進(jìn)一步發(fā)生發(fā)展［21，22］。

醒腦靜注射液是臨床常用的中成藥急救藥品，具有清熱瀉火，涼血解毒，醒腦開竅的功效，可用于治療多種腦血管神經(jīng)系統(tǒng)疾病［23］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，醒腦靜注射液可通過(guò)血腦屏障直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)揮抗炎，抗氧化，抑制細(xì)胞凋亡，改善腦微循環(huán)，減輕腦水腫等效應(yīng)［24，25］。同時(shí)還可有效地保護(hù)缺血半暗帶，減少溶栓后毒性反應(yīng)的發(fā)生［26］。但是溶栓療法尚未得到廣泛普及［27］，因此觀察醒腦靜注射液是否能直接作用于缺血半暗帶區(qū)，促進(jìn)半暗帶轉(zhuǎn)化并緩解腦缺血損傷為本研究的重點(diǎn)。NVU 作為一種新型卒中治療策略于2001 年被提出，其主要由神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞（包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)）和微血管等結(jié)構(gòu)組成，共同維持著神經(jīng)元的正常生理過(guò)程以及受損神經(jīng)元的修復(fù)［28，29］。腦梗死發(fā)生后，NVU 中的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和微血管等會(huì)受到不同程度損傷，各組分之間的相對(duì)平衡會(huì)被打破，引起一系列級(jí)聯(lián)損傷反應(yīng)［30，31］。本研究結(jié)果觀察顯示，醒腦靜注射液可促進(jìn)腦缺血急性期半暗帶區(qū)NVU 神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和微血管的修復(fù)，減輕其各組分的病理形態(tài)改變。凋亡在急性缺血性中風(fēng)的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮著重要作用。在缺血性中風(fēng)的早期，缺血中心的腦血流量急劇下降，發(fā)生壞死性神經(jīng)細(xì)胞死亡［32］。但缺血半暗帶周圍的神經(jīng)細(xì)胞仍具有代謝活性，死亡主要以凋亡為主，其形態(tài)學(xué)特征是核固縮，細(xì)胞膜泡沫形成和凋亡小體的形成［33］。本研究結(jié)果亦顯示，醒腦靜注射液可部分恢復(fù)缺血半暗帶區(qū)損傷的神經(jīng)元，抑制細(xì)胞凋亡。

影像學(xué)是缺血性腦卒中診斷的基石，不僅對(duì)急性缺血性卒中，而且對(duì)亞急性和慢性缺血性腦損傷也是如此［34］。研究發(fā)現(xiàn)，在急性大腦中動(dòng)脈閉塞中，每分鐘大約會(huì)丟失190 萬(wàn)個(gè)神經(jīng)元，而早期的影像學(xué)檢查能幫助臨床醫(yī)師抓住最佳診療時(shí)間［20］。缺血半暗帶區(qū)為腦梗死核心區(qū)周圍由于腦血流灌注不足而導(dǎo)致神經(jīng)功能受損的腦組織，但仍可維持細(xì)胞正常電活動(dòng)，尚存在可挽救的神經(jīng)元細(xì)胞［35］。因此，快速準(zhǔn)確識(shí)別半暗帶區(qū)域并統(tǒng)計(jì)一定時(shí)間內(nèi)半暗帶丟失面積可作為判斷腦梗死治療是否有效的一個(gè)關(guān)鍵性觀察指標(biāo)。目前臨床上用于評(píng)估腦梗死后半暗帶面積的主要影像學(xué)方法包括CT 灌注成像、MRI 磁共振成像、正電子發(fā)射體層攝影等［36］，臨床研究發(fā)現(xiàn)在急性腦梗死超早期的診斷上MRI更具優(yōu)勢(shì)，且能夠明確識(shí)別潛在可存活的半暗帶組織和不可存活的梗死核心區(qū)，對(duì)于臨床診斷及治療具有十分重要的意義［37，38］。目前普遍認(rèn)為PDM 是臨床判斷缺血性半暗帶的“金標(biāo)準(zhǔn)”，是鑒定半暗帶面積最有效的影像學(xué)方法。通過(guò)DWI 反映核心梗死區(qū)，PWI 反映所有血流灌注降低的區(qū)域，二者的差值被廣泛應(yīng)用于判定半暗帶區(qū)域。本研究將MCAO 大鼠ADC 和CBF 不匹配區(qū)域定義為缺血半暗帶區(qū)域，結(jié)果顯示，24 h 較缺血半暗帶區(qū)較4.5 h較少，而梗死面積卻相應(yīng)增加。通過(guò)PDM 所得到的參數(shù)并按照一定公式計(jì)算4.5 h 到24 h 的半暗帶丟失率，結(jié)果顯示，醒腦靜組的半暗帶丟失率低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明醒腦靜注射液能夠在一定程度上抑制大鼠腦缺血急性期半暗帶轉(zhuǎn)化。

綜上所述，醒腦靜注射液能夠改善缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元狀態(tài)，減少膠質(zhì)細(xì)胞和微血管損傷，并抑制細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)化為不可逆的梗死組織較模型組減少，在一定程度上挽救部分半暗帶，對(duì)腦缺血急性期半暗帶區(qū)腦組織具有一定的保護(hù)作用。不足的是，本實(shí)驗(yàn)未能從分子機(jī)制層面探討醒腦靜注射液對(duì)大鼠腦缺血急性期半暗帶轉(zhuǎn)化的影響，有待進(jìn)一步深入研究，為臨床上治療急性腦梗死提供更多的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為通訊作者，動(dòng)物造模實(shí)驗(yàn)實(shí)施為第一作者和第二作者，病理染色實(shí)驗(yàn)為第四作者和第五作者，核磁及分析為第二、七作者，統(tǒng)計(jì)為第三、六作者，第一、二、三作者共同執(zhí)筆，通訊作者為審校。