Checkerboard法對(duì)ε-聚賴氨酸和殼聚糖抑菌作用的研究

魏奇，白偉娟，鐘鑫榮，王曉贇，張承康，張維瑞，3，陳美霞*，劉盛榮，3*

（1.寧德師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100；2.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350000；3.閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心，福建 寧德 352100；4.廈門(mén)市燕之屋絲濃食品有限公司，福建 廈門(mén) 361100）

近年來(lái)，隨著消費(fèi)習(xí)慣的變化，消費(fèi)者對(duì)食品的需求也隨之發(fā)生變化。防腐劑在食物當(dāng)中所起到的關(guān)鍵作用是抑制食品中微生物的生長(zhǎng)，防止食品出現(xiàn)因微生物產(chǎn)生的腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，從而延長(zhǎng)食品的貯藏期[1]。天然食品防腐劑，具有較好的抑菌和保鮮的作用，能夠避免化學(xué)防腐劑殘留物對(duì)人體產(chǎn)生較大的毒副作用。因此，天然防腐劑也越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞[2-4]。

ε-聚賴氨酸是一種從微生物中篩選出的天然防腐抑菌劑，具有良好防腐性能和熱穩(wěn)定性等特點(diǎn)，存在巨大的商業(yè)潛力[5]。ε-聚賴氨酸是由鏈霉菌好氧發(fā)酵產(chǎn)生，研究表明其在人體中能夠直接降解成賴氨酸，對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害，是一種天然的生物防腐劑[6-7]。ε-聚賴氨酸已被證實(shí)不會(huì)對(duì)生物體的生長(zhǎng)、生育繁殖、神經(jīng)和免疫方面產(chǎn)生毒副作用，因此可作為一種天然、安全的食品防腐劑[8]。ε-聚賴氨酸主要的抑菌機(jī)制是通過(guò)破壞微生物的細(xì)胞形態(tài)，損傷細(xì)胞膜，引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的酶及蛋白質(zhì)的代謝紊亂，從而引起機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終破壞細(xì)胞的功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。殼聚糖是一種天然的氨基酸多糖，具有廣譜抑菌作用，能夠有效抑制金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和大腸桿菌等食源性致病菌，并且有自發(fā)成膜的物理特性，能夠在食品的表面形成透明無(wú)色的薄膜。因其無(wú)毒無(wú)害且無(wú)副作用，所以廣泛應(yīng)用于食品的生產(chǎn)和加工[10-11]。殼聚糖的抑菌作用主要是通過(guò)抑制微生物的生長(zhǎng)，降低三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶活性，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致菌體死亡[12]。目前，殼聚糖可以廣泛應(yīng)用于果蔬保鮮，達(dá)到延緩果實(shí)衰老、抑菌防腐、保證果蔬品質(zhì)、延長(zhǎng)果蔬貯藏期的效果。因此，殼聚糖可以延長(zhǎng)食品的貯藏期。

殼聚糖和ε-聚賴氨酸是一種天然食品防腐抑菌劑，具有較好的抑菌和保鮮作用。殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配使用時(shí)，殼聚糖形成薄膜吸附在細(xì)胞膜上，影響了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入，從而達(dá)到抑菌的作用[13-15]。有研究報(bào)道，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)合涂膜能夠延長(zhǎng)中國(guó)對(duì)蝦的保質(zhì)期，減少中國(guó)對(duì)蝦的汁液流失，減少微生物數(shù)量[16]。殼聚糖和ε-聚賴氨酸具有協(xié)同作用，能夠改善貯藏期間櫻桃的硬度和色澤，可以提高櫻桃的貯藏品質(zhì)[17]。因此，開(kāi)發(fā)殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)合保鮮劑對(duì)提高食品品質(zhì)和延長(zhǎng)食品貯藏期具有十分重要的意義。

天然食品防腐劑的復(fù)配應(yīng)用，有助于提高防腐劑的保鮮效果，增加抑菌譜，減少用量而降低成本。本文對(duì)殼聚糖與ε-聚賴氨酸復(fù)配的抑菌效果進(jìn)行研究，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，采用微量稀釋法來(lái)測(cè)定殼聚糖、ε-聚賴氨酸及其復(fù)配溶液的最低抑菌濃度，采用Checkerboard法探究殼聚糖和ε-聚賴氨酸抑菌活性，并分析兩者復(fù)配溶液對(duì)細(xì)菌的影響，該研究可為ε-聚賴氨酸和殼聚糖在食品中的科學(xué)復(fù)配應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）：寧德師范學(xué)院微生物室提供。

1.1.2 試劑

ε-聚賴氨酸（食品級(jí)）：浙江新銀象生物工程有限公司；殼聚糖（食品級(jí)）：北京索萊寶科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯：廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9272A電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9070A鼓風(fēng)干燥箱：上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ-2D凈化工作臺(tái)、YXQ-SG46-280S全自動(dòng)高壓滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；THZ-100恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YP802N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；YC-300L數(shù)控低溫保存箱：中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶劑配制

ε-聚賴氨酸溶液制備：用去離子水配制ε-聚賴氨酸溶液（2%）。殼聚糖溶液制備：用0.5%冰醋酸制備殼聚糖溶液（0.1%）。

1.3.2 培養(yǎng)基配制

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制：稱取營(yíng)養(yǎng)瓊脂干粉（33 g）加入1 L蒸餾水，高溫高壓滅菌（121℃，15 min）。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配制：稱取營(yíng)養(yǎng)肉湯干粉（18 g）加入1 L蒸餾水，高溫高壓滅菌（121℃，15 min）。

1.3.3 菌種活化

在超凈工作臺(tái)中，將兩種供試菌接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.4 菌液制備

在超凈工作臺(tái)中，分別取上述少量活化后的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，接種至30 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h（150 r/min，35℃）。

1.3.5 最小抑菌濃度測(cè)定

96孔板中加入100 μL ε-聚賴氨酸溶液（或殼聚糖溶液）和100 μL菌液濃度為106CFU/mL的大腸桿菌（或金黃色葡萄球菌）。分別在24、48 h和72 h后觀察，測(cè)定最小抑菌濃度。表1為ε-聚賴氨酸和殼聚糖溶液的濃度。

表1 殼聚糖和ε-聚賴氨酸的濃度Table 1 The concentration of ε-polylysine and chitosan

1.3.6 Checkerboard法測(cè)試

殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液的濃度如表2所示。按照Checkboard法測(cè)定殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液的聯(lián)合抑菌作用。

表2 殼聚糖、ε-聚賴氨酸復(fù)配濃度Table 2 The combined concentration of ε-polylysine and chitosan

1.3.7 Checkerboard法計(jì)算聯(lián)合抑菌指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）值

采用Checkerboard法計(jì)算FICI值，從而評(píng)估殼聚糖和ε-聚賴氨酸相互抑菌作用[18-19]。FICI計(jì)算公式如下。FICI=殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液MIC/殼聚糖MIC+殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液MIC/ε-聚賴氨酸MIC

當(dāng) FICI≤0.5 時(shí)，為協(xié)同效應(yīng)；0.5＜FICI≤1，為相加效應(yīng)；1＜FICI≤2，為無(wú)關(guān)效應(yīng)；FICI>2，為拮抗效應(yīng)。

1.3.8 蛋白質(zhì)泄漏量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[20]的方法，測(cè)定蛋白質(zhì)泄漏量。取5 mL的金黃色葡萄球菌菌液，離心5 min（8 000 r/min，4℃）后棄上清液，用0.85%的生理鹽水將菌液重懸至40 mL。吸取 2 mL ε-聚賴氨酸溶液（35 μg/mL）、殼聚糖溶液（180 μg/mL）和復(fù)配溶液（16 μg/mL ε-聚賴氨酸、100 μg/mL殼聚糖）分別與2 mL金黃色葡萄球菌菌液混勻，處理時(shí)間為72 h。樣品用0.85%的生理鹽水稀釋5倍，離心5 min（8 000 r/min，4℃）后測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，無(wú)菌生理鹽水作為空白對(duì)照，計(jì)算蛋白質(zhì)泄漏量。

取5 mL的大腸桿菌菌液，離心5 min（8 000 r/min，4℃）后棄上清液，用0.85%的生理鹽水將菌液重懸至40 mL。吸取 2 mL ε-聚賴氨酸溶液（20 μg/mL）、殼聚糖溶液（240 μg/mL）和復(fù)配溶液（6 μg/mL ε-聚賴氨酸、100 μg/mL殼聚糖）分別與2 mL大腸桿菌菌液混勻，處理時(shí)間為72 h。樣品用生理鹽水稀釋5倍，離心5 min（8 000 r/min，4℃）后測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，無(wú)菌生理鹽水作為空白對(duì)照，計(jì)算蛋白質(zhì)泄漏量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值，應(yīng)用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并用Graphpad Prism 9作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的影響

殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度見(jiàn)表3。

表3 殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度Table 3 Minimum inhibitory concentration of chitosan against Staphylococcus aureus and Escherichia coli

由表3可知，殼聚糖的抑菌活性隨著殼聚糖濃度增加而增強(qiáng)。不同處理時(shí)間下，殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為180 μg/mL。當(dāng)抑制時(shí)間24 h時(shí)，殼聚糖對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為200 μg/mL。當(dāng)抑制時(shí)間48、72 h時(shí)，殼聚糖對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為240 μg/mL。由此可知，當(dāng)抑制時(shí)間為72 h時(shí)，殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（180 μg/mL）小于對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度（240 μg/mL）。

2.2 ε-聚賴氨酸對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的影響

ε-聚賴氨酸對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度見(jiàn)表4。

表4 ε-聚賴氨酸對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度Table 4 Minimum inhibitory concentration of ε-polylysine against Staphylococcus aureus and Escherichia coli

由表4可知，當(dāng)抑制時(shí)間為24 h時(shí)，ε-聚賴氨酸對(duì)金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為25 μg/mL；ε-聚賴氨酸對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為15 μg/mL。當(dāng)抑制時(shí)間為48 h時(shí)，ε-聚賴氨酸對(duì)金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為35 μg/mL，ε-聚賴氨酸對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為20 μg/mL。當(dāng)抑制時(shí)間為72 h時(shí)，ε-聚賴氨酸對(duì)金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為35 μg/mL；ε-聚賴氨酸對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為20 μg/mL。由此可知，ε-聚賴氨酸對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度小于金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度。

2.3 Checkerboard法測(cè)試抑菌效果

2.3.1 殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的影響

采用Checkerboard法評(píng)價(jià)殼聚糖和ε-聚賴氨酸的復(fù)配溶液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果，并根據(jù)FICI指數(shù)預(yù)測(cè)殼聚糖和ε-聚賴氨酸之間的相互抑菌作用的類型。殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果見(jiàn)表5。

表5 殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Table 5 The antibacterial activity of the combination of chitosan and ε-polylysine against Staphylococcus aureus

由表5可知，當(dāng)抑制時(shí)間為24、48 h時(shí)，殼聚糖和ε-聚賴氨酸的 FICI值為 1.01～1.29（1＜FICI≤2），由此提示殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的相互作用的類型為無(wú)關(guān)效應(yīng)。當(dāng)抑制時(shí)間為72 h時(shí)，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對(duì)金黃色葡萄球菌具有疊加抑菌的作用（0.5＜FICI≤1）。由此可知：當(dāng)抑制時(shí)間為72 h時(shí)，16 μg/mL ε-聚賴氨酸和 100 μg/mL 殼聚糖的復(fù)配溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳。

2.3.2 殼聚糖和ε-聚賴氨酸對(duì)大腸桿菌的影響

殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果見(jiàn)表6。

由表6可知，當(dāng)抑制時(shí)間為48、72 h時(shí)，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對(duì)大腸桿菌均具有疊加抑菌的作用（0.5＜FICI≤1）。與抑制時(shí)間24 h相比，在抑制時(shí)間為48、72 h條件下，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對(duì)大腸桿菌疊加抑菌作用更加穩(wěn)定。由此可知，抑制時(shí)間為 72 h 時(shí)，6 μg/mL ε-聚賴氨酸和 100 μg/mL 殼聚糖的復(fù)配溶液對(duì)大腸桿菌的抑制作用最佳。

表6 殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果Table 6 The antibacterial activity of the combination of chitosan and ε-polylysine against Escherichia coli

2.3.3 不同抑菌劑對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)泄漏量的影響

不同抑菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)泄漏量的影響見(jiàn)圖1。

通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)的泄漏可以用于評(píng)價(jià)抑菌劑的抑菌效果。由圖1可知，殼聚糖、ε-聚賴氨酸及殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)泄漏量顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05）。由此可知，殼聚糖、ε-聚賴氨酸及其復(fù)配溶液能夠?qū)е陆瘘S色葡萄球菌的蛋白質(zhì)發(fā)生泄漏，由此導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的失活。殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液導(dǎo)致的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)泄漏作用顯著高于單獨(dú)使用殼聚糖和ε-聚賴氨酸（P<0.05）。由此可知，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性強(qiáng)于殼聚糖和ε-聚賴氨酸單獨(dú)使用的抑菌效果。

圖1 不同抑菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌的蛋白質(zhì)泄露量的影響Fig.1 Effect of different preservative on the protein released from Staphylococcus aureus

不同抑菌劑對(duì)大腸桿菌的蛋白質(zhì)泄漏量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同抑菌劑對(duì)大腸桿菌的蛋白質(zhì)泄漏量的影響Fig.2 Effect of different preservative on the protein released from Escherichia coli

由圖2可知，殼聚糖、ε-聚賴氨酸及殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液對(duì)大腸桿菌的蛋白質(zhì)泄漏量顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05）。由此可知，殼聚糖、ε-聚賴氨酸及其復(fù)配溶液能夠?qū)е麓竽c桿菌的蛋白質(zhì)發(fā)生泄漏，導(dǎo)致大腸桿菌失活。殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液導(dǎo)致的大腸桿菌的蛋白質(zhì)泄漏量顯著高于單獨(dú)使用殼聚糖和ε-聚賴氨酸（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

殼聚糖和ε-聚賴氨酸復(fù)配溶液會(huì)產(chǎn)生聚合物，增加微生物蛋白質(zhì)的泄漏量，使微生物失活，兩者對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有疊加抑菌作用。6 μg/mL ε-聚賴氨酸和100 μg/mL殼聚糖的復(fù)配溶液對(duì)大腸桿菌的抑制作用最佳。16 μg/mL ε-聚賴氨酸和 100 μg/mL殼聚糖的復(fù)配溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳。葉青青等[21]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖/聚賴氨酸復(fù)合膜對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑菌作用，試驗(yàn)結(jié)果與本研究結(jié)果一致。通過(guò)研究殼聚糖及ε-聚賴氨酸的復(fù)配溶液的抑菌效果，改變過(guò)去單一的保鮮方式，提高殼聚糖成膜的均勻性，增加ε-聚賴氨酸保鮮抑菌效果，為兩者在天然食品防腐劑中的配合應(yīng)用提供了理論參考。