體外模型研究制川烏和白芍配伍中重金屬鉛和鎘毒性

林路秀, 鄭靜茵

（1.閩南師范大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院,福建漳州363000；2.福建省現(xiàn)代分離分析科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建漳州363000；3.福建省污染監(jiān)測(cè)與控制省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建漳州363000）

中草藥中重金屬及有害元素污染對(duì)人類健康的影響越來(lái)越受到人們重視[1-2]，重金屬污染是影響中藥品質(zhì)和推廣使用的關(guān)鍵因素.當(dāng)人們食用受重金屬污染的食品或藥品，體內(nèi)重金屬含量達(dá)到一定程度時(shí)，會(huì)使組織器官發(fā)生病變，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，影響人類健康[3].例如高濃度的鉛和鎘會(huì)削弱機(jī)體免疫力，破壞生育力，造成腎損傷[4].川烏為毛茛科多年生草本植物烏頭的塊根，白芍為毛茛科多年生草本植物白芍的根，川烏與白芍是中醫(yī)治療風(fēng)濕痹證的傳統(tǒng)寒熱藥對(duì).

目前，川烏和白芍配伍研究大多集中在烏頭堿和芍藥苷等有機(jī)成分上[5-7]，對(duì)重金屬污染等安全問(wèn)題的研究報(bào)道較為少見(jiàn)[8].應(yīng)用體外胃腸仿生模型對(duì)食品藥品中重金屬毒性研究已有大量報(bào)道[9-11]，與大鼠等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖啾?，體外仿生模型更簡(jiǎn)便、易行，但已有仿生模型大部分只模擬胃或小腸部位的消化和吸收，較少模擬大腸和腸道微生物的作用[12-13].本文建立體外全消化道(口腔、胃、小腸和大腸)仿生-微生物代謝模型研究川烏和白芍單煎液及不同配伍水煎液中重金屬鉛和鎘的毒性，為川烏和白芍生產(chǎn)和使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供一定參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

Agilent 7500cx 系列ICP-MS (美國(guó)安捷倫公司)；MK-III 微波消解儀(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)；FR224CN 分析天平(美國(guó)奧豪斯)；梅特勒FE28 臺(tái)式pH 計(jì)(梅特勒-托利多)；DHG-9240A 電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司)；SHA-C 水浴恒溫振蕩器(常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠)；N-1300D 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(東京理化EYELA)；LDZX-50KBS 高壓滅菌鍋(上海申安)；BUGBOX-SM 厭氧培養(yǎng)箱(英國(guó)Ruskin 科技有限公司)；DFT-50A 手提式萬(wàn)能高速粉碎機(jī)(上海比朗儀器有限公司)；DW-86L390Y 超低溫冰箱(青島澳柯瑪超低溫冷凍設(shè)備有限公司)；Millipore Mill-Q 超純水機(jī)(美國(guó)，Millipore公司).

1.2 材料與方法

制川烏和白芍購(gòu)買(mǎi)于漳州市老瑞林藥店，經(jīng)漳州市衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥學(xué)專家謝偉容實(shí)驗(yàn)師鑒定.楊樹(shù)葉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：GBW07604(GSV-3)，購(gòu)買(mǎi)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心網(wǎng)(www.bwsm.org)；100 mg·L-1Pb 和Cd單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，逐級(jí)稀釋法配制濃度分別為：0,10,20,50,100和200μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液；100 mg·L-1的45Sc, 72Ge, 103Rh, 115In, 209Bi 內(nèi)標(biāo)溶液稀釋成500μg·L-1濃度使用；10μg·L-1的7Li, 89Y, 140Ce, 204Tl, 59Co 調(diào)諧溶液稀釋成1μg·L-1濃度使用，上述溶液均用5%硝酸溶液稀釋.69%~70%濃硝酸(優(yōu)級(jí)純，德國(guó)默克公司)、30%過(guò)氧化氫(優(yōu)級(jí)純)；濃鹽酸(優(yōu)級(jí)純)；磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀、硫氰酸鉀、磷酸鈉、氯化鈣、碳酸氫鈉、磷酸二氫鈉、氯化銨、氯化鎂、氫氧化鈉、葡萄糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、PBS緩沖液、鹽酸半胱氨酸、酵母抽提物、瓊脂、尿素、尿酸、粘蛋白、牛血清蛋白購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑中國(guó)公司；α-淀粉酶(>1 000 U/mg)、胃蛋白酶(>250 U/mg)、胰蛋白酶(>2 000 U/mg)、脂肪酶(>200單位/mg)、膽汁購(gòu)于美國(guó)西格瑪公司、δ-纖維素酶(>50 U/mg)、δ-木聚糖酶(>2 500 U/mg)、β-葡聚糖酶(>50單位/mg)、δ-果膠酶(>500 U/mg)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，以上試劑均為分析純.實(shí)驗(yàn)所需的所有容器洗凈后，10%硝酸浸泡48 h，最后用超純水沖洗干凈.

1.3 制川烏和白芍單味藥水煎劑及不同配伍水煎劑的制備

制川烏是中藥川烏炮制加工品，制川烏和白芍中藥洗凈后，于80 ℃烘箱中恒溫烘干至恒重，備用.根據(jù)《中醫(yī)方劑大辭典》記載的川烏(A)與白芍(B)配伍方劑208 首中配伍比例1A︰1B 占59.96%，1A︰2B，2A︰1B 和2A︰3B 共占15.29%[14]，因此本研究將配伍比例設(shè)定為1A︰1B，1A︰2B 和2A︰1B，同時(shí)與制川烏和白芍單味藥進(jìn)行對(duì)照.

制川烏單煎液：稱取制川烏20.0 g，加水10倍量，浸泡30 min，加熱至沸騰，保持微沸約1 h，煎煮3次，每次加超純水200 mL，合并3次煎煮液，趁熱過(guò)濾，加熱濃縮，定容至250 mL，于4 ℃下保存?zhèn)溆?白芍單煎液，稱取白芍20.0 g；制川烏白芍1︰1配伍水煎液，稱取制川烏20.0 g，白芍20.0 g；制川烏白芍1︰2配伍水煎液，稱取制川烏20.0 g，白芍40.0 g；制川烏白芍2︰1 配伍水煎液，稱取制川烏40.0 g，白芍20.0 g；白芍單煎液及制川烏和白芍不同配伍(1A︰1B，1A︰2B 和2A︰1B)水煎液煎煮及濃縮方法同制川烏單煎液的制備.

1.4 口腔、胃、小腸、膽汁和大腸仿生消化液的制備

口腔、胃、小腸、膽汁和大腸仿生消化液的制備參考文獻(xiàn)[12-13,15]，即根據(jù)人體消化部位，加入對(duì)應(yīng)消化器官含有的無(wú)機(jī)物、有機(jī)物、生物酶，調(diào)節(jié)pH值.

1.5 大腸微生物菌液接種和培養(yǎng)

人體大腸微生物菌群的接種和體外培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[16-17]：從三位身體健康志愿者(在過(guò)去一年內(nèi)未食用抗生素類藥物)，收集新鮮糞便，等量混合后加入磷酸鹽緩沖溶液中(0.1 mol/L)，勻漿5 min，靜置10 min，取5 mL上清液以10 000 r/min離心10 min,上層菌液用于接種實(shí)驗(yàn)用.

參考文獻(xiàn)[16]制備腸道微生物培養(yǎng)液：稱取3.0 g 酵母，3.0 g 胰蛋白，3.0 g 葡萄糖，0.05 g 硫代硫酸鈉，0.5 g 鹽酸半胱氨酸，0.1 g 磷酸氫鉀，蒸餾水1 000 mL，混合，調(diào)節(jié)pH=6.6~6.9，培養(yǎng)液于121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min，37 ℃恒溫箱保存?zhèn)溆?以1︰10 的比例將上層菌液接種，即取100 mL 上層菌液，接種至1 000 mL 培養(yǎng)液中，充氮?dú)?，將培養(yǎng)液放入37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，獲得穩(wěn)定純化腸道微生物菌落.微生物接種和培養(yǎng)所用儀器均在121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min，操作過(guò)程于37 ℃無(wú)氧超潔凈工作臺(tái)上.

1.6 制川烏和白芍單煎液及其配伍水煎液胃腸仿生消化及微生物代謝

參考文獻(xiàn)[18]制備胃、腸仿生消化和微生物代謝食靡：第一組，分別取50 mL制川烏和白芍單煎液、配伍水煎液，分別加入5 mL唾液，恒溫(37 ℃)振蕩5 min，分別加入30 mL胃液，再恒溫(37 ℃)振蕩2 h，得胃消化食靡；第二組，分別取單煎液和配伍水煎液50 mL，胃仿生消化后(方法同胃消化食靡制備)，繼續(xù)分別加入30 mL 十二指腸液和15 mL 膽汁，恒溫(37 ℃)振蕩7 h，得小腸消化食靡；第三組，分別取單煎液和配伍水煎液50 mL，小腸消化后分別加入30 mL 大腸消化液和15 mL 經(jīng)穩(wěn)定純化的腸道微生物菌液，充氮?dú)?，?7 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，得大腸消化和微生物代謝食靡.在相同方法下用超純水代替仿生消化液做空白實(shí)驗(yàn).胃腸仿生消化及微生物代謝食靡于-80 ℃下保存待用.

1.7 樣品中鉛和鎘測(cè)定

制川烏和白芍藥粉預(yù)處理：樣品粉碎，分別精密稱取0.5 g制川烏和白芍藥粉，分別放入消解罐中，分別加入8.0 mL 濃硝酸和4.0 mL 過(guò)氧化氫，于80 ℃水浴中處理約20 min，待黃煙散盡，補(bǔ)加4.0 mL 濃硝酸和2.0 mL過(guò)氧化氫，按操作規(guī)程安裝好裝置，消解10 min，冷卻，消解液定容至25 mL；制川烏和白芍單煎液及配伍水煎液、仿生消化食靡預(yù)處理：分別取5 mL 水煎液、仿生消化食糜，分別加入消解罐中，分別加4.0 mL 濃硝酸和2.0 mL 過(guò)氧化氫，消解10 min，冷卻，消解液定容至25 mL，同法同時(shí)做空白試驗(yàn).ICP-MS法測(cè)定藥粉、水煎液、胃腸仿生消化和微生物代謝食糜中鉛和鎘含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 Pb和Cd元素測(cè)定的準(zhǔn)確度分析

楊樹(shù)葉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中Pb和Cd元素的鑒定值和測(cè)定值見(jiàn)表1，重金屬Pb和Cd的測(cè)定結(jié)果均在鑒定值范圍內(nèi)，且Pb 和Cd 元素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.8%以內(nèi).結(jié)果表明分析方法準(zhǔn)確，符合Pb 和Cd 測(cè)定要求，可用于制川烏和白芍藥粉、水煎液及其仿生消化食靡中Pb和Cd的測(cè)定.

表1 楊樹(shù)葉(GBW07604)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中Pb和Cd元素的測(cè)定Tab.1 Determination of lead and cadmium in poplar leaves(GBW07604)(n=3)

2.2 制川烏和白芍樣品及其配伍水煎液中重金屬Pb和Cd含量

制川烏和白芍樣品及其不同配伍水煎液中重金屬Pb 和Cd 含量見(jiàn)表2.根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版規(guī)定草藥中Pb和Cd的標(biāo)準(zhǔn)限值分別為5 mg/kg和1 mg/kg[19].從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，制川烏藥粉中重金屬Pb 為2.88 mg/kg，Cd 為0.53 mg/kg，白芍藥粉中Pb 為2.01 mg/kg，Cd 為0.10 mg/kg，均低于國(guó)家現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn).制川烏和白芍單味藥及其配伍水煎液中Pb 元素含量≤0.81 mg/kg，Cd 元素含量≤0.07 mg/kg，Pb和Cd 元素溶出率都較低(4.3%～21%)，制川烏和白芍藥材經(jīng)過(guò)煎煮后重金屬Pb 和Cd 小部分溶出(≤21%)，水煎液中重金屬含量降低，比較攝入制川烏和白芍顆粒劑，人體攝入水煎劑方式重金屬含量降低，其毒性也不同[13].

2.3 制川烏和白芍單煎液及其配伍水煎液胃腸仿生消化及腸道微生物代謝食靡中Pb和Cd含量

制川烏和白芍單煎液及配伍水煎液胃腸仿生消化及腸道微生物代謝食靡中Pb 和Cd 含量見(jiàn)表3 所示.制川烏和白芍單味藥及其配伍水煎液中Pb 元素含量≤0.81 mg/kg，Cd 元素含量≤0.09 mg/kg.制川烏和白芍單味藥及其配伍水煎液經(jīng)過(guò)胃仿生消化后，食靡中Pb元素含量≤0.17 mg/kg，Cd元素含量≤素含量g mg/kg；小腸仿生消化后，小腸仿生消化食靡中Pb元素含量≤素含06 mg/kg，Cd元素含量≤素含量32 mg/kg,Cd元素只有川烏單味藥水煎液測(cè)出，其他均未測(cè)出；大腸仿生消化和微生物代謝食靡中，除制川烏和白芍單味藥水煎液食靡中測(cè)出微量的Pb 元素，其他配伍水煎液大腸消化和微生物代謝食靡中Pb 元素含量低于儀器檢出限，未測(cè)出；Cd元素也低于儀器檢出限，均未測(cè)出.

表3 制川烏(A)和白芍(B)單煎液及其配伍水煎液、胃腸仿生消化和腸道微生物代謝食靡中鉛和鎘含量(n=3)Tab.3 Contents of Pb and Cd in single and different combinations of decoction of Aconitum carmichaeli Debx.(A)and Paeonia lactiflora Pall.(B)from bionic gastrointestinal digestive and intestinal microbial metabolism chyme(n=3).

由表中變化趨勢(shì)看，經(jīng)過(guò)胃消化后食靡中Pb 和Cd 濃度略微降低，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)小腸消化，小腸消化食靡中Pb和Cd濃度再次降低，而大腸消化和微生物代謝食靡中Pb和Cd濃度儀器基本檢測(cè)不出，中草藥中重金屬釋放、遷移和轉(zhuǎn)化受胃腸酸度、消化酶、腸道菌群和藥草中有機(jī)成份的影響.進(jìn)入胃腸消化道后，經(jīng)過(guò)消化液消化和微生物代謝，重金屬被消化液稀釋導(dǎo)致濃度降低，同時(shí)與消化液中有機(jī)或無(wú)機(jī)成分發(fā)生反應(yīng)，其形態(tài)發(fā)生變化，毒性也發(fā)生相應(yīng)變化.

3 結(jié)論

水煎劑是中草藥最常用的服用方法，中草藥中有效成分煎出的同時(shí)，有毒成分(如重金屬)也會(huì)煎出，中草藥水煎液中重金屬進(jìn)入胃腸消化道后經(jīng)過(guò)消化液消化和微生物代謝，重金屬也將與消化液中有機(jī)或無(wú)機(jī)成分發(fā)生反應(yīng)，其形態(tài)發(fā)生變化，毒性也發(fā)生相應(yīng)變化.目前，2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定草藥中的Pb和Cd最大殘留限量分別為5 mg/kg和1 mg/kg.從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，制川烏和白芍藥粉中重金屬Pb和Cd的含量均低于國(guó)家現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，而制川烏和白芍單煎液及其配伍水煎液中Pb元素含量≤0.81 mg/kg，Cd 元素含量≤0.07 mg/kg，Pb 和Cd 元素溶出率≤21%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定草藥中的Pb 和Cd 最大殘留限量，由此表明我國(guó)居民在飲用含制川烏和白芍中草藥方劑時(shí)Pb 和Cd 暴露水平很低.