芙蓉膏對家兔皮膚軟組織感染的抑菌抗炎作用
2021-12-21 14:04:28高家榮于慶生
安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報 2021年6期
薛 雪，高家榮，于慶生，張 琦
(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)
芙蓉膏是安徽省名老中醫(yī)湯琢成研制的外用膏劑經(jīng)驗方，是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，以木芙蓉葉為主藥，配以藤黃、生天南星、冰片、薄荷油等，經(jīng)特殊工藝調(diào)制而成。芙蓉膏臨床應(yīng)用廣泛，對感染性疾病如皮膚軟組織化膿性感染、闌尾周圍膿腫、早期褥瘡，以及非感染性炎癥類疾病都具有顯著的療效。目前，尚未見關(guān)于芙蓉膏對體表軟組織感染抑菌抗炎作用的規(guī)范性實驗研究。本研究以家兔為研究對象，探討芙蓉膏對體表軟組織感染的抑菌抗炎作用及其機制。
1 材料
1.1 菌株 金黃色葡萄球菌菌株(ATCC 29213)和大腸埃希菌菌株(ATCC 25922)均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科微生物室提供。
1.2 動物 選取健康清潔級新西蘭家兔50只，月齡3個月，雌雄各半，體質(zhì)量(2.0±0.5)kg，由安徽省實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證編號為SCXK(皖)2018-006。飼養(yǎng)條件：室溫(20～25)℃和相對濕度(55%～65%)適宜，保持空氣流通，正常光照，動物自由飲水及進食，飲用水為凈化水，墊料定期更換。
1.3 藥物與試劑 青霉素紙片、芙蓉膏(成品前粉劑滅菌備用)由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，批號為皖藥制Z20050068；復(fù)方黃柏液涂劑，由山東漢方制藥有限公司生產(chǎn)，每瓶100 mL；莫匹羅星軟膏，由中美天津史克制藥有限公司生產(chǎn)，每支10 g，國藥準字號為H10930064；硫化鈉，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供。兔腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒(貨號：CK-E80109R)、兔白細胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)試劑盒(CK-E80171R)、兔超敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)試劑盒(貨號：CK-E80045R)均由上海源葉生物科技有限公司提供。
1.4 儀器 MH瓊脂平板：鄭州安圖生物工程股份有限公司；Densichek plus比濁儀：上海起發(fā)實驗試劑有限公司；DNP-9052BS-Ⅲ型電熱恒溫箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；XW-80A旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；標準滅菌濾紙片(直徑6 mm，厚0.1 mm)：安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科微生物室；RM2145型切片機：德國Leica公司生產(chǎn)；DNM-9602G型酶標儀：北京普朗新技術(shù)有限公司；Olympus CX31型光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司；JW3021HR型離心機：安徽嘉文儀器裝備有限公司。
2 方法
2.1 抑菌實驗
2.1.1 分組、干預(yù)方法及檢測指標 分實驗組(濃度為0.3 g/mL芙蓉膏粉劑溶液)、復(fù)方黃柏涂劑組、青霉素組。采用紙片瓊脂擴散法進行抑菌實驗。肉眼觀察3種藥物對金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌菌株的生長是否具有抑制作用，如具有抑制作用，用毫米刻度尺測量各組抑菌環(huán)并記錄。
2.1.2 檢測方法 在無菌試管中將滅菌芙蓉膏粉劑與滅菌水按1∶3的比例混勻，標明為芙蓉膏粉劑溶液后取3個樣本，分別涂于血培養(yǎng)皿中(37 ℃恒溫箱中培養(yǎng))，培養(yǎng)7 d無細菌生長者判斷為無菌；將12片直徑6 mm、厚0.1 mm的標準濾紙片隨機平均分成兩組，分別浸于芙蓉膏粉劑溶液和復(fù)方黃柏液涂劑中，制成藥片。嚴格按照細菌培養(yǎng)要求進行細菌懸液配制：金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌分別接種于普通固體瓊脂平板培養(yǎng)基(24 h)，然后用接種環(huán)再挑單一菌落置于無菌試管的滅菌水中，用Densichek plus比濁儀配制濃度為1.5×10/mL的標準菌株的金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌菌液；用滅菌棉簽涂布濃度為1.5×10/mL的標準菌株菌液3遍于MH瓊脂平板表面；MH瓊脂平皿上均放入含有3組藥液的藥片，然后置于37 ℃孵育箱中孵育16 h，測量抑菌環(huán)直徑，每組測量3次，最后取平均值。
2.2 抗炎實驗
2.2.1 動物的分組、模型復(fù)制、干預(yù)方法 參照李儀奎的方法復(fù)制軟組織感染模型。在新西蘭家兔后背部直徑5 cm的范圍內(nèi)先剪毛再脫毛，脫毛采用6%硫化鈉，20%烏拉坦按3～4 mL/kg的劑量于24 h后經(jīng)耳緣靜脈注射給藥，麻醉滿意后取脫毛區(qū)直徑4 cm區(qū)域為無菌操作范圍，皮下注射金黃色葡萄球菌0.5 mL(1.5×10CFU/mL)，12 h后出現(xiàn)紅、腫、熱、痛為模型復(fù)制成功。用隨機數(shù)字表法將50只新西蘭家兔分為5組(每組10只)，分別為空白組，模型組，莫匹羅星組，芙蓉膏高、低劑量組。空白組、模型組采用生理鹽水外涂脫毛處，每次涂擦約5 mL，莫匹羅星組、芙蓉膏高劑量組每次涂藥物厚度5 mm，芙蓉膏低劑量組涂藥物厚度3 mm，每日1次。每次換藥后用紗布包好，連續(xù)用藥7 d，單籠單只飼養(yǎng)。
2.2.2 觀察指標及檢測方法
(1)脫毛區(qū)組織形態(tài)學(xué)變化 用滅菌組織剪將家兔背部脫毛區(qū)剪下半徑約4 cm的皮下病變組織固定于10%中性甲醛溶液中，經(jīng)過乙醇序列脫干水分后，用石蠟包埋，切成薄片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察脫毛區(qū)組織病理變化(主要包括膿腫大小、炎癥反應(yīng)、成纖維細胞數(shù)量及纖維組織增生情況)。
(2)全血白細胞(white blood cell, WBC)、中性粒細胞(neutrophil, NE)數(shù)量檢測 將家兔放置兔架上固定，沿家兔耳緣靜脈采集1.5 mL血液，放入含有EDTA抗凝劑的采血管中，采用血細胞分析儀檢測用藥后第2、4、7天各組家兔全血中WBC、NE數(shù)量。
(3)血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平檢測 在用藥后第2、4、7天應(yīng)用ELISA法檢測各組家兔血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平，具體操作按測試盒說明書進行。
3 結(jié)果
3.1 抑菌實驗結(jié)果 芙蓉膏粉劑溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)直徑為2.5 mm(n
=3)，對大腸埃希菌無明顯抑制作用；復(fù)方黃柏涂劑對金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌均無明顯抑制作用；青霉素紙片對金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)為6 mm(n
=3)，對大腸埃希菌無明顯抑制作用。3.2 各組大鼠后背脫毛區(qū)軟組織形態(tài)學(xué)變化比較 正常組大鼠后背脫毛區(qū)軟組織內(nèi)無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠后背脫毛區(qū)軟組織有膿腫形成，伴大量炎癥細胞浸潤；莫匹羅星組大鼠后背脫毛區(qū)軟組織內(nèi)有少量炎癥細胞浸潤；芙蓉膏高劑量組大鼠后背脫毛區(qū)軟組織內(nèi)炎癥明顯減輕，膿腫縮小，少量炎癥細胞浸潤，亦可見纖維組織增生及少量新生毛細血管；芙蓉膏低劑量組大鼠后背脫毛區(qū)軟組織膿腫縮小，部分炎癥細胞浸潤，亦可見纖維組織增生。見圖1。
圖1 各組家兔后背脫毛區(qū)軟組織的形態(tài)學(xué)變化(HE染色，10×40倍)
3.3 各組大鼠全血WBC、NE計數(shù)比較 隨著治療時間延長，模型組和莫匹羅星組，芙蓉膏低、高劑量組大鼠全血中WBC、NE計數(shù)較前一時點顯著降低(P
<0.
05)。與正常組比較，模型組家兔3個時點全血中WBC、NE均顯著高于正常組(P
<0.
05)。與模型組比較，莫匹羅星組，芙蓉膏低、高劑量組家兔3個時點全血中WBC、NE計數(shù)均顯著降低(P
<0.
05)或呈降低趨勢(P
>0.
05)。芙蓉膏高劑量組大鼠3個時點全血中WBC計數(shù)顯著低于芙蓉膏低劑量組(P
<0.
05)。見表1。
表1 各組家兔外周血WBC、NE計數(shù)比較
3.4 各組大鼠血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平比較 隨著治療時間延長，模型組和莫匹羅星組，芙蓉膏低、高劑量組大鼠血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6水平較前一時點顯著降低(P
<0.
05)或呈降低趨勢(P
>0.
05)。與正常組比較，治療第2、4、7天模型組家兔血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平顯著高于正常組(P
<0.
05)。與模型組比較，莫匹羅星組，芙蓉膏低、高劑量組3個時點血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平均顯著降低(P
<0.
05)或呈降低趨勢(P
>0.
05)。治療第7天，芙蓉膏高劑量組家兔血清TNF-α、IL-6水平顯著低于芙蓉膏低劑量組(P
<0.
05)。見表2。
表2 各組家兔血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6水平比較
4 討論
體表軟組織感染是指各種化膿性病原菌侵犯表皮、真皮、皮下組織引起的炎癥性疾病，通常為細菌感染，主要表現(xiàn)為病變部位的紅、腫、熱、痛等。體表軟組織感染屬中醫(yī)“瘡瘍”范疇，多為火熱之毒所致。西醫(yī)治療多采用抗生素、魚石脂軟膏等，臨床效果有限。中醫(yī)藥在治療體表軟組織感染方面發(fā)揮了重要的作用。芙蓉膏臨床用于治療體表軟組織感染已有40余年，療效顯著。芙蓉膏組方中的木芙蓉葉功能清熱涼血、消腫止痛?！侗静菥V目·木部·芙蓉》記載木芙蓉葉外用主治癰疽腫毒、一切瘡腫。實驗研究也表明木芙蓉葉提取物有抑菌活性。藤黃能消腫、攻毒、祛腐斂瘡，藥理研究認為其有效成分藤黃酸具有抑制炎癥、抗細菌的作用。生天南星功能散結(jié)消腫，外治癰腫。研究發(fā)現(xiàn)天南星抗炎和鎮(zhèn)痛效果顯著?！缎滦薇静荨分杏涊d冰片有清熱止痛之功效，現(xiàn)代研究表明其抗炎作用確切，具有良好的透皮吸收作用。薄荷油消炎止癢，外用可使皮膚或黏膜產(chǎn)生清涼感。本研究分別從抑菌實驗與抗炎實驗角度，證實芙蓉膏對體表軟組織感染的抑菌抗炎作用。
抑菌實驗結(jié)果顯示，芙蓉膏粉劑溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)為2.5 mm，其抑菌作用顯著，這也是其促進軟組織感染修復(fù)的原因。組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，芙蓉膏高劑量組僅有少量炎癥細胞浸潤，膿腫縮小，芙蓉膏低劑量組亦有部分炎癥細胞浸潤，說明不同劑量芙蓉膏對細菌所致兔軟組織感染均有治療作用，高劑量芙蓉膏更加顯著。WBC和NE是細菌性感染的常用指標，臨床應(yīng)用價值較高。本實驗結(jié)果顯示，不同劑量的芙蓉膏均可降低模型家兔血WBC、NE計數(shù)，高劑量組降低更加顯著(P
<0.
05)。hs-CRP、IL-6、TNF-α均屬于機體炎癥標志物，含量越高代表感染越嚴重。hs-CRP是急性時相反應(yīng)蛋白，由肝細胞分泌，是細菌性感染評估指標之一。TNF-α可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，能增強WBC對內(nèi)皮細胞的粘附，促進炎癥發(fā)生。IL-6可放大和催化炎癥反應(yīng)，增強TNF-α的效應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示，不同劑量芙蓉膏均能夠降低血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平，說明外用芙蓉膏可經(jīng)皮吸收進入血液循環(huán)，直達炎癥組織，抑制炎癥反應(yīng)，從而影響全身性炎癥指標的變化。與芙蓉膏低劑量組比較，高劑量組hs-CRP、TNF-α、IL-6水平降低更加顯著，進一步說明高劑量組治療效果優(yōu)于低劑量組。本實驗研究表明，芙蓉膏對金黃色葡萄球菌生長有抑制作用，可減輕家兔后背感染軟組織的炎癥反應(yīng)，促進創(chuàng)面修復(fù)，高劑量效果更優(yōu)。其作用機制可能與降低血WBC、NE計數(shù)，調(diào)節(jié)促炎因子TNF-α、IL-6水平有關(guān)。
