高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒鞋橡膠部件中兩種亞硝基胺*

王麗華，林東翔，張玉潔，李 燕，陸婷婷，周 蓉

(南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 210028)

N-亞硝基胺化合物是具有-N-N=O官能團(tuán)物質(zhì)的總稱，是一類很強(qiáng)的化學(xué)致癌物質(zhì)，在已發(fā)現(xiàn)的300多種N-亞硝基胺化合物中，約有90%能使40種受試動(dòng)物發(fā)生腫瘤。N-亞硝基胺可通過呼吸道、消化道以及皮膚的吸收進(jìn)入體內(nèi)從而誘發(fā)癌變。大量的動(dòng)物試驗(yàn)表明，它們?cè)谌梭w內(nèi)可能會(huì)將DNA烷基化，最終誘發(fā)癌癥，其致癌性已經(jīng)被公認(rèn)。橡膠制品中的N-亞硝基胺主要來自以仲胺為基礎(chǔ)的硫化促進(jìn)劑和硫磺給予體分解后給出仲胺，然后與空氣中或配合劑中的氮氧化物(NOx)在酸性條件下生成穩(wěn)定的N-亞硝基胺[1]。在特定的環(huán)境下，橡膠制品中的N-亞硝基胺被釋放出來，從而有可能對(duì)人體造成巨大的危害。嬰幼兒鞋是指鞋號(hào)不大于170 mm，3周歲以下嬰幼兒穿用的鞋，嬰幼兒鞋是兒童用品中重要的一類，其質(zhì)量安全對(duì)于兒童的成長和健康有重要的影響。兒童及嬰幼兒群體處于生理、心理和認(rèn)知成長的發(fā)育時(shí)期，受行為能力和心智水平的限制，自我保護(hù)意識(shí)較弱，極易受到外界環(huán)境和產(chǎn)品的影響和傷害[2]。例如嬰幼兒好奇心強(qiáng)，有時(shí)會(huì)吸吮鞋子，這會(huì)使童鞋和孩子的皮膚，眼睛甚至口腔直接接觸，從而導(dǎo)致鞋子表面上殘留的有害物質(zhì)傷害嬰幼兒的身體健康，N-亞硝基胺就是其中一類?？紤]到兒童群體的特殊性，若日常穿用的鞋的橡膠部件中N-亞硝基胺含量不符合要求，所造成的危害比成年人更加嚴(yán)重。因此應(yīng)對(duì)兒童鞋中N-亞硝基胺含量高度重視。強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)GB 30585《兒童鞋安全技術(shù)規(guī)范》中要求，嬰幼兒鞋橡膠部件中不應(yīng)檢出N-亞硝基胺。我國另外兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)GB 250365-2010《布面童膠鞋》和GB 25038-2010《膠鞋健康安全技術(shù)規(guī)范》，也對(duì)橡膠部件中N-亞硝基胺規(guī)定為不得檢出。

目前N-亞硝基胺的檢測(cè)方法主要有分光光度法[3]、氣相色譜-熱能分儀儀聯(lián)用法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-7]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、高效液相色譜法[9]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]。由于氣相色譜-熱能分儀儀聯(lián)用法儀器比較昂貴，且適用性比較窄，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法儀也比較貴，很多實(shí)驗(yàn)室也都不具備。GB 30585-2014中規(guī)定嬰幼兒鞋中橡膠部件中亞硝基胺的檢測(cè)方法為GB/T 24153給定的測(cè)試方法：氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法，是一個(gè)比較通用的方法，所用色譜柱也是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)最常規(guī)的色譜柱類型。但實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，12種亞硝基胺物質(zhì)中的其中兩種亞硝基胺化合物N-亞硝基-N-甲基苯胺(NMPhA)和N-亞硝基-N-乙基苯胺(NEPhA)在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的進(jìn)樣口溫度為260 ℃下會(huì)分解成N-甲基苯胺(MPhA)和N-乙基苯胺(EPhA)，這是因?yàn)檫@兩種物質(zhì)具有熱不穩(wěn)定性[11]。因此，按照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 24153[12]規(guī)定的方法實(shí)際樣品檢測(cè)中當(dāng)檢測(cè)出這兩種物質(zhì)時(shí)，有可能是樣品種含有的MPhA或EPhA，就會(huì)造成假陽性結(jié)果。

本研究主要建立一種高效液相法來準(zhǔn)確測(cè)定NMPhA和NEPhA，作為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定方法的一種補(bǔ)充，當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)出這兩種亞硝基胺時(shí)，進(jìn)一步使用高效液相方法進(jìn)行定性和定量，以避免假陽性的結(jié)果，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度，滿足檢測(cè)需求。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要儀器和試劑

儀器：Agilent 1260Infinity II超高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器；超聲波清洗機(jī)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；BUCHI R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦有限公司；固相萃取裝置：配有真空泵，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；XS204電子天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司。

試劑；甲醇，乙腈為色譜純，TEDIA試劑有限公司；N-亞硝基-N-甲基苯胺NMPhA和N-亞硝基-N-乙基苯胺NMPhA、N-甲基苯胺(MPhA)和N-乙基苯胺(EPhA)標(biāo)準(zhǔn)樣品，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；超純水(MilliQ制備)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別準(zhǔn)確稱取每種亞硝基胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.10 g(精確至 0.1 mg)，用甲醇定容至100 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，裝于棕色試劑瓶中保存。臨用時(shí)根據(jù)需要將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品溶液制備

按照GB/T 24153給定的方法制備試樣溶液，整個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作過程如下，取有代表性的試樣，用適當(dāng)工具碎至邊長為 3 mm以下的顆粒，混勻。從混勻后的試樣中稱取5.0 g試料，至于錐形瓶中，加入30 mL甲醇，于超聲波發(fā)生器中超聲提取30 min，提取液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中，再往錐形瓶中加入20 mL甲醇，重復(fù)提取一次，合并提取液。濃縮瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，真空度控制在21.3～16.3 kPa，于35 ℃水浴中緩慢濃縮至稍少于4.5 mL，取下濃縮瓶，于漩渦混勻器上充分旋轉(zhuǎn)振蕩 1 min，將濃縮液中的樣液移入5 mL棕色容量瓶中。另取0.5 mL甲醇淋洗濃縮瓶壁，于漩渦混勻器上充分旋轉(zhuǎn)振蕩1min后，移入容量瓶合并，用甲醇定容至5 mL，搖勻。將C18固相萃取小柱致于固相萃取裝置上，用5 mL甲醇淋洗C18小柱。準(zhǔn)確吸取2.0 mL樣液注入小柱，流出液收集于離心管中。然后用緩慢氮?dú)饬鞔抵? mL,樣液搖勻后裝入棕色進(jìn)樣小瓶中，密封冷藏待測(cè)。

1.4 儀器色譜條件

色譜條件：色譜柱Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；流動(dòng)相：甲醇:水=65:35(體積比)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長的選擇

分別對(duì)NMPhA、NEPhA、MPhA以及EPhA標(biāo)準(zhǔn)溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，圖1為NMPhA的光譜掃描結(jié)果，NEPhA的光譜掃描結(jié)果與NMPhA類似，圖2為MPhA的光譜掃描結(jié)果，EPhA的光譜掃描結(jié)果與NMPhA類似。從圖1和圖2可以看出NMPhA、NEPhA和MPhA、EPhA的最大特征吸收波長不同，NMPhA和NEPhA在270nm處有強(qiáng)吸收，MPhA和EPhA在240 nm處有強(qiáng)吸收，由此可通過光譜定性鑒別NMPhA和MPhA、NEPhA和EPhA。為了更好的定性定量NMPhA和NEPhA，綜合考慮選擇檢測(cè)波長為270 nm。

圖1 NMPhA標(biāo)準(zhǔn)溶液光譜掃描圖

圖2 MPhA標(biāo)準(zhǔn)溶液光譜掃描圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別考察了乙腈:水=(65:35)、甲醇:水=(65:35)為流動(dòng)相對(duì)兩種亞硝基胺的分離效果，結(jié)果表明，兩種溶劑都能夠?qū)煞N亞硝基胺進(jìn)行有效分離，但由于乙腈的淋洗能力較強(qiáng)，出峰時(shí)間相對(duì)甲醇較短，且標(biāo)準(zhǔn)中樣品前處理萃取溶劑為甲醇，因此綜合考慮選擇甲醇/水作為流動(dòng)相。

考察了甲醇:水比例分別為80:20、70:30、65:35、 60:40、50:50時(shí)兩種亞硝基胺的分離效果，結(jié)果表明，甲醇:水比例分別為80:20、70:30時(shí)，出峰時(shí)間相對(duì)較短，峰形較窄，當(dāng)甲醇:水比例為60:40、50:50時(shí)，出峰時(shí)間相對(duì)較長，特別是50:50時(shí)，無法在10 min內(nèi)分離，同時(shí)峰寬相對(duì)較寬，綜合考慮，選擇甲醇:水=(65:35)作為流動(dòng)相。

在優(yōu)化的色譜條件下對(duì)四種濃度均為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，圖3是四種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖，結(jié)果表明，在選定的色譜條件下可以有效分離四種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中NMPhA和NEPhA保留時(shí)間分別為4.320 min和5.555 min，MPhA和EPhA的保留時(shí)間分別4.707 min和6.334 min。因此通過高效液相可以解決嬰幼兒鞋橡膠部件中亞硝基胺氣質(zhì)檢測(cè)中出現(xiàn)假陽性的問題。

圖3 四種亞硝基胺液相色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性相關(guān)性及檢出限

在選定的色譜條件下進(jìn)一步對(duì)該分析方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

配置濃度均為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL的NMPhA和NEPhA標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的液相色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以濃度x為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)y，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到濃度-峰面積線性關(guān)系曲線，NMPhA的線性回歸方程為：y=33.60270x-3.02975，相關(guān)系數(shù)R2為0.99949，NEPhA的回歸線性方程為：y=23.90825x-3.12566，相關(guān)系數(shù)R2為0.99943，可見兩種亞硝基胺的濃度和峰面積都呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，可以用來定量計(jì)算。

將一定濃度的兩種亞硝基胺標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋并測(cè)定，根據(jù)信噪比(S/N)為3時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度確定為儀器的檢出限，信噪比(S/N)為10時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度確定為定量限，利用儀器自帶的軟件進(jìn)行信噪比計(jì)算得出NMPhA的檢出限為0.01 μg/mL,定量限為0.03 μg/mL，NEPhA的檢出限為0.04 μg/mL,定量限為0.11 μg/mL。根據(jù)1.3所述的前處理方法可知兩種亞硝基胺的方法檢出限分別為0.01 mg/kg和0.04 mg/kg.

2.4 檢測(cè)方法的精密度、準(zhǔn)確度

取經(jīng)檢測(cè)不含這兩種亞硝基胺的嬰幼兒鞋橡膠部件樣品3份進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為0.3 mg/kg、1.0 mg/kg、5.0 mg/kg，按照1.3所述樣品前處理方式進(jìn)行萃取濃縮并上機(jī)定量測(cè)定，同時(shí)每個(gè)加標(biāo)濃度分別重復(fù)測(cè)定7次，考察分析方法的精密度，結(jié)果見表1。

由表1可知，加標(biāo)回收率在88.5%～108.6% 之間，RSD在0.86%～2.44%之間，方法具有較好的穩(wěn)定性，表明所建立的分析方法得到的測(cè)定結(jié)果比較可靠。

表1 兩種亞硝基胺的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

從超市及批發(fā)市場(chǎng)等處隨機(jī)購買20雙嬰幼兒童鞋，取其橡膠部件按照1.3所述方法進(jìn)行前處理，并用建立的液相方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果均未檢出這兩種亞硝基胺。

3 結(jié) 論

N-亞硝基胺類是禁止在嬰幼兒鞋橡膠部件使用的一類強(qiáng)致癌物質(zhì)，其中N-亞硝基-N-甲基苯胺和N-亞硝基-N-乙基苯胺按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定方法檢測(cè)易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，導(dǎo)致誤判。因此，本研究建立了一種高效液相色譜法來分離和測(cè)定兩種亞硝基胺，以甲醇:水=65:35(體積比)為流動(dòng)相，在波長為 270 nm，流動(dòng)相流量為1.0 ml/L，采用Eclipse XDB-C18色譜柱和二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，兩種亞硝基胺在0.2～ 10 mg/L范圍下內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，樣品加標(biāo)回收率在88.5%～108.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<5%，檢出限分別為0.01 mg/kg和0.04 mg/kg。該方法可用于嬰幼兒鞋橡膠部件中N-亞硝基-N-甲基苯胺和N-亞硝基-N-乙基苯胺的定性定量測(cè)定，避免假陽性結(jié)果，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。