MiR-671-3p通過CKAP4抑制結(jié)腸癌細胞的增殖和遷移

楊 欣，盧癸鳳，胡文慧，肖 智，耿 飛

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

結(jié)腸癌目前是世界上確診排名前列的腫瘤，并且易復(fù)發(fā)和對化療藥物耐藥，患者致死率逐年上升[1]。目前，手術(shù)和化療是結(jié)腸癌的主要治療手段，手術(shù)影響患者的生活質(zhì)量，化療具有毒副作用[1-2]?；虻漠惓１磉_被認為參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。然而，關(guān)于結(jié)腸癌的發(fā)病機制仍有待于進一步的研究，新的生物學(xué)標志物和治療靶點的發(fā)現(xiàn)將有助于結(jié)腸癌診療方法的發(fā)展。

微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA,長度為20～22個核苷酸，被認為可以調(diào)控基因的表達[3-4]。微小RNA通過結(jié)合靶基因的3’UTR區(qū)抑制信使RNA的翻譯[5-6]，從而參與細胞的增殖、凋亡和分化[7-8]。已有大量微小RNA被揭示參與調(diào)控腫瘤的進程[9-12]。然而，結(jié)腸癌相關(guān)的微小RNA和它們的調(diào)控機制還有待于新的發(fā)現(xiàn)。最近的研究顯示miR-671-3p在多種癌癥中發(fā)揮著重要作用[13-14]。在膠質(zhì)瘤細胞中，過表達miR-671-3p可以通過靶基因CDR1-AS、CDR1和ASNL1顯著增加細胞的遷移和增殖能力[13]。miR-671分為miR-671-5p和miR-671-3p，其中miR-671-5p可以促進結(jié)腸癌的增殖[15]。然而，miR-671-3p在結(jié)腸癌中的作用及其機制還有待于研究。本研究主要探討了miR-671-3p在結(jié)腸癌中的作用及其潛在的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人結(jié)腸癌細胞株RKO及SW620由遵義醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室保存。RMPI 1640培養(yǎng)基購買自美國Hyclone公司；胎牛血清和胰酶購自Gibico生物公司；miR-671-3p mimic及抑制劑購自廣州銳博生物科技公司；Trizol試劑購買自Invitrogen公司；Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑及BCA蛋白檢測試劑盒購買自美國賽默飛世爾科技公司；熒光定量PCR相關(guān)試劑購買自TAKARA公司；miR-671-3p RT-PCR引物由銳博公司合成； CCK-8試劑盒購買自日本同仁公司；PVDF膜購買自美國Millipore公司；CKAP4一抗購買自武漢三鷹生物公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購買自Abcam公司；Boyden Transwell小室購買自美國BD公司。6孔板、24孔板、96孔板、培養(yǎng)瓶等購買自NEST公司。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)直腸癌細胞株RKO和SW620細胞培養(yǎng) RKO及SW620來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫，由遵義醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室保存，采用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃，含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒擴增 商品化的CKAP4過表達及對照質(zhì)粒購買自維真生物公司(濟南)，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒小搖等一系列擴大培養(yǎng)，以獲取足夠質(zhì)粒用于后續(xù)的回復(fù)實驗。

1.2.3 RKO和SW620，及CKAP4過表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 miR-671-3p mimic及抑制劑由銳博公司設(shè)計和合成。選取狀態(tài)良好的結(jié)直腸癌細胞株RKO及SW620，胰酶消化吹打成均勻細胞懸液后鋪于6孔板內(nèi)，第2天待細胞長到合適密度(70%～80%)，給予每孔5 μL mimic或抑制劑瞬時轉(zhuǎn)染，分為陰性對照組(NC)及實驗組，轉(zhuǎn)染6～8 h后更換含有10%胎牛血清的RMPI 1640繼續(xù)培養(yǎng)。過表達CKAP4的實驗則分為陰性對照組及過表達組，每孔轉(zhuǎn)染4 μg質(zhì)粒6～8 h后，更換含10%胎牛血清的RMPI 1640繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 實時熒光定量PCR 收集轉(zhuǎn)染24 h后的細胞，用Trizol提取細胞總RNA，測定濃度后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA,反應(yīng)條件為37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋5倍后備用。熒光定量PCR被用來檢測miR-671-3p的水平，U6作為內(nèi)參對照。檢測相應(yīng)的Ct值，以Ct值計算實驗組和對照組miR-671-3p的相對表達量，計算公式為ΔΔCt=(CtmiR- CtU6)實驗組-(CtmiR- CtU6)對照組。

1.2.5 蛋白免疫印跡實驗 收集培養(yǎng)的細胞，用RIPA緩沖液裂解，緩沖液里含有蛋白酶抑制劑。蛋白濃度通過BCA蛋白檢測試劑盒測定。取30 μg蛋白通過10%聚丙烯酰胺凝膠分離。而后，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜用5%的脫脂奶粉封閉1 h，然后CKAP4一抗(16686-1-AP,1∶1 000)孵育過夜。第二天，用含有辣根過氧化物酶的二抗孵育，ECL試劑盒檢測。β-actin作為內(nèi)參對照。

1.2.6 細胞遷移實驗 孔徑8 μm的Transwell小室(不含Matrigel)被用來檢測細胞的遷移能力。用200 μL不含有胎牛血清的培養(yǎng)基消化重懸細胞，取1×105個細胞接種在小室的上層。500 μL包含胎牛血清的培養(yǎng)基加入到小室的下層。37 °C孵育2～6 d(其中RKO細胞2～3 d，SW620細胞4～6 d)，用棉花擦去上室的細胞，穿越到下室的細胞用甲醇固定1 h，0.1%結(jié)晶紫染色30 min至1 h。顯微鏡下觀察穿過膜的細胞，隨機取5個視野進行拍照，計算5個視野細胞的平均值作為遷移的細胞數(shù)。

1.2.7 細胞增殖實驗 選取生長狀態(tài)良好的結(jié)腸癌細胞株RKO及SW620鋪板瞬時轉(zhuǎn)染。24 h后，胰酶消化重懸細胞，計數(shù)。按照96孔板每孔1 000個細胞接種轉(zhuǎn)染的細胞，每組3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后使用CCK8法檢測每孔的OD值：吸出培養(yǎng)基，加入100 μL CCK8混合液(培養(yǎng)基：CCK8試劑為9∶1的比例)，37 ℃孵育2～4 h。酶標儀檢測490 nm處的OD值，隔天測1次，得出細胞增殖曲線。

1.2.8 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析 來源于TCGA數(shù)據(jù)庫(http://cancergenome.nih.gov/)的臨床數(shù)據(jù)用來分析CKAP4在結(jié)腸癌中的表達。同時，相關(guān)的臨床信息也被用來分析CKAP4對結(jié)腸癌患者預(yù)后生存時間的分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理，兩組均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，增殖實驗數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量雙因素方差分析，取α=0.05為檢驗標準。

2 結(jié)果

2.1 過表達miR-671-3p抑制結(jié)腸癌細胞的遷移和增殖 為了檢測miR-671-3p在結(jié)腸癌生物學(xué)行為中作用，進行了一系列實驗。首先，在RKO和SW620細胞轉(zhuǎn)染miR-671-3p mimic及其空白對照(NC)，qRT-PCR檢測過表達效率，結(jié)果顯示miR-671-3p被成功過表達(見圖1A)。Tranwell小室及CCK8實驗用來檢測細胞的遷移和增殖能力。和對照組相比，RKO細胞過表達miR-671-3p可以使細胞的增殖能力降低(圖1B,F=10.525，P=0.032)。同樣，miR-671-3p也減少了SW620細胞的增殖(圖1C,F=19.09，P=0.012)。在細胞遷移實驗中，過表達miR-671-3p后RKO細胞的遷移能力顯著被抑制(圖1D和E,t=11.688，P<0.001)。而miR-671-3p也抑制了SW620細胞的遷移(圖1D和E,t=5.84，P=0.004)。以上實驗結(jié)果提示miR-671-3p可以顯著抑制結(jié)腸癌細胞的增殖和遷移能力。

A:轉(zhuǎn)染miR-671-3p mimic后miR-671-3p在RKO和SW620細胞中的表達；B:miR-671-3p對RKO細胞增殖的影響；C:miR-671-3p抑制SW620細胞的增殖；D和E:miR-671-3p對RKO和SW620細胞遷移能力的影響；*：與對照組比較，P<0.05；**：與對照組比較，P<0.01;***：與對照組比較，P<0.001。圖1 過表達miR-671-3p對結(jié)腸癌細胞遷移和增殖的影響

2.2 抑制miR-671-3p促進結(jié)腸癌細胞的增殖和遷移 為進一步確證miR-671-3p的效應(yīng)，在RKO和SW620細胞轉(zhuǎn)染miR-671-3p抑制劑及其對照，qRT-PCR檢測抑制效率，結(jié)果顯示miR-671-3p被成功抑制(見圖2A)。和對照組相比， miR-671-3p抑制劑可以促進RKO細胞(圖2B,F=142.137，P<0.001)和SW620細胞(圖2C,F=27.886，P=0.006)的增殖，提示了增強的增殖能力。而細胞轉(zhuǎn)染miR-671-3p抑制劑使miR-671-3p表達降低后，RKO細胞(圖2D和E,t=-4.867，P=0.008)和SW620細胞(圖2D和E,t=-7.991，P=0.001)遷移的數(shù)量增加，意味著可以顯著增強細胞的遷移能力。

A：轉(zhuǎn)染miR-671-3p抑制劑后miR-671-3p在RKO和SW620細胞中的表達；B：miR-671-3p抑制劑促進RKO細胞的增殖；C：miR-671-3p抑制劑促進SW620細胞的增殖；D和E：miR-671-3p抑制劑增強RKO和SW620細胞的遷移；**：與對照組比較，P<0.01;***：與對照組比較，P<0.001。圖2 抑制miR-671-3p促進結(jié)腸癌細胞的遷移和增殖

2.3 miR-671-3p調(diào)控CKAP4的表達 本課題組之前關(guān)于膠質(zhì)瘤的研究揭示了miR-671-3p可以和CKAP4結(jié)合，并在膠質(zhì)瘤細胞中調(diào)控CKAP4的表達[16]。為了探索miR-671-3p是否能調(diào)控結(jié)腸癌細胞中CKAP4的表達，分別在RKO細胞和SW620細胞中過表達miR-671-3p，應(yīng)用蛋白免疫印跡實驗檢測CKAP4的表達水平。結(jié)果顯示，miR-671-3p能顯著降低RKO細胞(圖3A和B,t=3.315，P=0.03)和SW620細胞(圖3A和B,t=3.189，P=0.033)中CKAP4的表達水平。這揭示了miR-671-3p能調(diào)控結(jié)腸癌中CKAP4的表達。

2.4 CKAP4在結(jié)腸癌中表達上調(diào) 上面的結(jié)果揭示了miR-671-3p可以直接調(diào)控結(jié)腸癌細胞CKAP4的表達。為了探索CKAP4在結(jié)腸癌進程中的角色，TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌患者的數(shù)據(jù)被用來分析CKAP4的臨床相關(guān)性。結(jié)果顯示，CKAP4在結(jié)腸癌中表達顯著上調(diào)(圖4A，P<0.001),但是對結(jié)腸癌患者的生存時間沒有影響(見圖4B)，揭示了CKAP4在結(jié)腸癌中的潛在作用。

A和B：miR-671-3p抑制CKAP4蛋白的表達；*：與對照組比較，P<0.05。圖3 miR-671-3p調(diào)控CKAP4的表達

A：CKAP4在結(jié)腸癌患者標本中的表達；B：CKAP4表達對結(jié)腸癌患者生存率的影響； ***：與對照組比較，P<0.001。圖4 CKAP4在結(jié)腸癌中的表達

2.5 過表達CKAP4逆轉(zhuǎn)miR-671-3p所導(dǎo)致的抑癌效應(yīng) 為了揭示CKAP4對體外結(jié)腸癌細胞增殖和遷移的影響，進一步確證CKAP4參與miR-671-3p對結(jié)腸癌細胞調(diào)控的過程，構(gòu)建了CKAP4過表達質(zhì)粒。過表達miR-671-3p后，CKAP4的表達降低，因此，在過表達miR-671-3p的同時過表達CKAP4基因，檢測是否能消除miR-671-3p的效應(yīng)。結(jié)果顯示，過表達CKAP4可以逆轉(zhuǎn)miR-671-3p所導(dǎo)致的效應(yīng)，RKO細胞(圖5A,F=13.728，P=0.006)和SW620細胞(圖5A,F=8.586，P=0.017)的增殖能力增加。另外，在過表達miR-671-3p的同時過表達CKAP4也能增強RKO細胞(圖5B和C,F=24.213，P=0.001)和SW620細胞(圖5B和C,F=87.762，P<0.001)的遷移能力。這些結(jié)果顯示，miR-671-3p對結(jié)腸癌細胞的調(diào)控是通過下游基因CKAP4實現(xiàn)的。

A：過表達CKAP4阻斷了miR-671-3p對RKO和SW620細胞的增殖；B和C：轉(zhuǎn)染miR-671-3p mimic和CKAP4過表達質(zhì)粒對RKO和SW620細胞遷移的影響；**：與對照組比較，P<0.01;***：與對照組比較，P<0.001。圖5 過表達CKAP4逆轉(zhuǎn)miR-671-3p所導(dǎo)致的抑癌效應(yīng)

3 討論

最近的一些研究顯示，微小RNA已被應(yīng)用于結(jié)直腸癌的診斷和分類[17-18]，顯示了微小RNA的巨大潛能。在本研究中，首先探討了miR-671-3p在結(jié)腸癌細胞中的生物學(xué)作用，miR-671-3p可以調(diào)控體外結(jié)腸癌細胞CKAP4的表達水平，利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析了miR-671-3p的下游靶基因CKAP4在結(jié)腸癌中的表達，而過表達CKAP4可以逆轉(zhuǎn)miR-671-3p對結(jié)腸癌的抑癌效應(yīng)。這些結(jié)果提示miR-671-3p/CKAP4信號影響結(jié)腸癌的進程。

研究顯示miR-671在乳腺癌中是一個抑癌因子，過表達miR-671抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲[14]。然而，在膠質(zhì)瘤中過表達miR-671則可以促進腫瘤細胞的增殖和遷移[13]。這些結(jié)果表明，miR-671在不同的腫瘤中發(fā)揮著不同的效應(yīng)。miR-671分為miR-671-5p和miR-671-3p兩種形式，其成熟序列不同。miR-671-3p在結(jié)腸癌中的作用還不清楚。本研究中，在結(jié)腸癌細胞過表達和抑制miR-671-3p，結(jié)果顯示miR-671-3p在結(jié)腸癌中發(fā)揮著抑癌的效應(yīng)。那么miR-671-3p是怎么發(fā)揮效應(yīng)的呢？本課題組之前的研究表明，miR-671-3p能結(jié)合CKAP4,并在膠質(zhì)瘤細胞中調(diào)控CKAP4的表達[16]。本研究中，在結(jié)腸癌細胞中過表達miR-671-3p，CKAP4的表達也下降，提示了miR-671-3p能調(diào)控CKAP4的表達。CKAP4位于細胞的表面，屬于Ⅱ型跨膜蛋白，它是多種配體的受體[19-20]。CKAP4參與到腫瘤的進程中，但是它可能發(fā)揮著促癌或者抑癌的效應(yīng)[21]。本研究中，TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌的數(shù)據(jù)被用來分析CKAP4的表達及其對結(jié)腸癌患者預(yù)后生存時間的影響。分析結(jié)果顯示，CKAP4在結(jié)腸癌中表達上調(diào)，但是對結(jié)腸癌患者的生存時間沒有影響。CKAP4可以降低結(jié)腸細胞的凋亡[22]，其異常變化和結(jié)直腸癌的嚴重程度相關(guān)[23]。這些表明CKAP4在結(jié)腸癌中是一個腫瘤促癌因子，它是miR-671-3p的下游靶分子。

雖然miR-671-3p能調(diào)控CKAP4的表達，那么CKAP4是否參與到miR-671-3p對結(jié)腸癌的調(diào)控過程呢？為了解決這個問題，本研究在過表達miR-671-3p的同時過表達CKAP4。結(jié)果顯示，過表達CKAP4能增強結(jié)腸癌細胞的增殖和遷移能力，從而逆轉(zhuǎn)了miR-671-3p的效應(yīng)，提示了miR-671-3p通過CKAP4發(fā)揮對結(jié)腸癌細胞的抑制效應(yīng)。

本研究利用結(jié)腸癌細胞株RKO及SW620，說明miR-671-3p抑制結(jié)腸癌細胞的遷移和增殖，提示其可能是抑癌因子，為結(jié)腸癌的診療提供了可能的靶點。在機制方面，本研究提出了miR-671-3p/CKAP4信號抑制結(jié)腸癌的進程，而關(guān)于體內(nèi)方面的實驗研究還有待于進一步的開展。