巨尾桉精油及主要化合物對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響

唐鳳鸞，陳月圓，李典鵬，趙 健

(廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所/廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541006)

桉樹(shù)原產(chǎn)于澳大利亞，是一種速生工業(yè)用材樹(shù)種。由于其生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性廣、經(jīng)濟(jì)效益好，被引種到世界各地。然而，過(guò)量種植桉樹(shù)已造成了一系列生態(tài)問(wèn)題，如生物多樣性下降[1-2]、土壤退化[3]、對(duì)本地物種的化感作用[4]等。化感物質(zhì)是植物產(chǎn)生和積累的次生代謝物，幾乎存在于所有植物物種組織中[5-9]。植物通過(guò)釋放化感物質(zhì)調(diào)節(jié)其附近的土壤微生物群落、影響草食動(dòng)物、改變周圍環(huán)境的化學(xué)和物理性質(zhì)，或直接抑制種子萌發(fā)、生長(zhǎng)和競(jìng)爭(zhēng)性植物物種的發(fā)育[10-11]。

桉樹(shù)能釋放大量揮發(fā)性化合物，這些物質(zhì)一部分被土壤顆粒吸附或溶解在水中[12]，其中部分化合物通過(guò)根系吸收對(duì)其他物種造成傷害，從而影響植物生長(zhǎng)[13-14]。如檸檬桉揮發(fā)物對(duì)雜草和農(nóng)作物的生長(zhǎng)具有化感作用，剛果12號(hào)桉揮發(fā)物對(duì)中國(guó)本土豆科草本植物具有抑制作用[15]，尾葉桉揮發(fā)物對(duì)金合歡和合歡幼苗生長(zhǎng)有明顯抑制作用[16]。盡管現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)桉樹(shù)葉片總揮發(fā)物的化感作用進(jìn)行了較廣泛的研究，但很少涉及揮發(fā)物中單體化合物的化感作用。事實(shí)上，揮發(fā)物的某些成分可明顯抑制或刺激其他物種的種子萌發(fā)和胚根伸長(zhǎng)[17-18]。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)廣西主要人工林巨尾桉的葉片精油進(jìn)行分析，并進(jìn)一步探討精油及主要化合物對(duì)黃瓜種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響，旨在評(píng)估人工桉樹(shù)林對(duì)周邊地區(qū)黃瓜生產(chǎn)的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

在廣西國(guó)有黃冕林場(chǎng)，選取四年生巨尾桉(Eucalyptusgrandis×E.urophylla)人工林為采樣基地，將其分為東、南、西、北、中等5個(gè)部分。于2019年5月，在每個(gè)部分隨機(jī)選取10棵長(zhǎng)勢(shì)均勻、無(wú)病蟲(chóng)危害的巨尾桉樹(shù)，將每棵樹(shù)的樹(shù)冠分為上、中、下三層，分別從每一層的東、南、西、北4個(gè)方向收集5個(gè)當(dāng)年生粗壯枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室后，摘取每條枝條的第6～15片成熟功能葉(從頂端開(kāi)始數(shù))，擦洗干凈，備用。

黃瓜(CucumissativusLinn)種子為山東省新泰市強(qiáng)大種業(yè)有限公司生產(chǎn)的油亮3-8 F1品種。發(fā)芽試驗(yàn)前，種子先用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡30 min進(jìn)行表面消毒。

1.2 精油提取及分析

將采集的巨尾桉新鮮葉片切成約2 cm大小的碎片，取適量葉片置于圓底燒瓶?jī)?nèi)加入蒸餾水，用揮發(fā)油提取器按常規(guī)水蒸氣蒸餾法加熱微沸4 h，得到油狀物經(jīng)分液漏斗用正己烷萃取分離，無(wú)水硫酸鈉干燥24 h，分離得到淡黃色精油，在4 ℃下保存。然后在所得精油中加入適量正己烷溶解，再用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液用于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析。

使用7890 A/5975 C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司生產(chǎn))對(duì)精油進(jìn)行分析。色譜條件為：HP-5 MS 5% Phenyl-Methyl Siloxane(30 m × 250 μm × 0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱；柱溫設(shè)定為以3 ℃·min-1的速度由60 ℃升至120 ℃，然后再以5 ℃·min-1的速度升至250 ℃；氣化室溫度為250 ℃；FID檢測(cè)器加熱器250 ℃,載氣為體積分?jǐn)?shù)99.999%的高純氦氣，載氣流量為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣方式為GC自動(dòng)進(jìn)樣器，進(jìn)樣量為1.0 μL，分流比為30∶1。質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃，電子能量為70 eV，MS四級(jí)桿溫度為150 ℃，接口溫度280 ℃。

檢測(cè)結(jié)果與Agilent NIST 05 a數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物的質(zhì)譜進(jìn)行比較，確定巨尾桉精油中的化合物，并在色譜條件下用C 6-C 28標(biāo)準(zhǔn)混合物計(jì)算樣品的保留指數(shù)(RI)。分析3次，計(jì)算各成分的相對(duì)百分比為平均值。

1.3 生物檢測(cè)方法

以黃瓜為測(cè)試植物，通過(guò)檢測(cè)種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)，研究巨尾桉精油及含量達(dá)1%的主要化合物的化感作用。

在培養(yǎng)皿(直徑90 mm)底部墊5層濾紙(用于吸水以保持濕度)，將滅菌后的黃瓜種子均勻置于培養(yǎng)皿上，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入7 mL待測(cè)溶液(精油或已知濃度的化合物)，以蒸餾水作為對(duì)照。其中水溶性低的化合物溶解于水∶丙酮比為97∶3的混合物中(單獨(dú)使用這種混合物與單獨(dú)用水的對(duì)照組相比沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差異)。培養(yǎng)皿放置于溫度為(25±1)℃，相對(duì)濕度為70%，連續(xù)光照20 μmol·(m2·s)-1或黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)5次，每個(gè)培養(yǎng)皿播20粒種子。在培養(yǎng)皿中直接觀察種子萌發(fā)情況，每12 h觀察一次，以胚根突破種皮為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，5 d后測(cè)定胚根長(zhǎng)度。

用于測(cè)試的純化合物購(gòu)自日本東京TCI公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件和SPSS 16.0軟件處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨尾桉精油分析結(jié)果

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)巨尾桉精油成份進(jìn)行分析，結(jié)果鑒定出52種化合物，具體見(jiàn)表1。其中相對(duì)含量較高的化合物有1,8-桉葉素(41.82%)、α-蒎烯 (39.54%)，占總含量的81.36%，為巨尾桉精油的主要成分。根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)將精油成分分為五類，第一類為含氧單萜類化合物(57.40%)，含量最高的為1,8-桉葉素(41.82%)，其次為α-松油醇乙酸萜烯(6.17%)，α-松油醇(4.33%)和2-茨醇(1.57%)；第二類為單萜烯類化合物(41.41%)，主要成分為α-蒎烯 (39.54%)；其他化合物僅占1.19%。

表1 巨尾桉精油化學(xué)成分Table 1 Chemical constituents of essential oil of E. urophydis

2.2 巨尾桉精油對(duì)黃瓜種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響

在光照和黑暗條件下，濃度為10～300 μg·mL-1的巨尾桉精油處理黃瓜種子120 h后的結(jié)果見(jiàn)表2。精油對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的抑制作用存在明顯的劑量依賴，隨使用濃度的增加而加強(qiáng)，且黑暗條件處理較光照條件更為明顯；濃度為10～20 μg·mL-1時(shí)，光照條件下種子萌發(fā)率與對(duì)照無(wú)明顯差異，但黑暗條件下萌發(fā)抑制率達(dá)12%～16%；濃度為150 μg·mL-1時(shí)嚴(yán)重抑制黃瓜種子萌發(fā)，抑制率達(dá)84%～88%。精油對(duì)黃瓜胚根生長(zhǎng)的影響較大，在所有測(cè)試條件和濃度下均能完全抑制胚根生長(zhǎng)。

表2 巨尾桉精油對(duì)黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of E. urophydis essential oil on seed germination and radicle growth of cucumber

2.3 巨尾桉精油中主要化合物對(duì)黃瓜種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響

在精油實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用同樣的生物檢測(cè)法，對(duì)含量在1%以上的5個(gè)主要化合物進(jìn)行化感作用測(cè)試。由表3可知，各測(cè)試化合物在光照和黑暗條件下對(duì)黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)的影響效果無(wú)顯著差異，這與精油實(shí)驗(yàn)中黑暗較光照條件抑制作用強(qiáng)的結(jié)果存在一定差異。測(cè)試化合物中，α-松油醇可完全抑制黃瓜種子萌發(fā)(抑制率100%)；α-松油醇乙酸萜烯和1,8-桉葉素的效果較接近，萌發(fā)抑制率在52%～68%之間，且能完全抑制胚根生長(zhǎng)；α-蒎烯和2-茨醇對(duì)萌發(fā)的抑制效果不明顯(6%～13%)，但α-蒎烯處理的種子胚根完全不能生長(zhǎng)，而2-茨醇對(duì)胚根長(zhǎng)生的抑制率分別為21%和40%。由此可見(jiàn)，巨尾桉精油主要化合物均能嚴(yán)重抑制黃瓜種子萌發(fā)或胚根生長(zhǎng)。

表3 主要化合物對(duì)黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of main compounds of E. urophydis essential oil on seed germination and radicle growth of cucumber

2.4 不同濃度化合物對(duì)黃瓜種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的影響

選取抑制效果較強(qiáng)的3種化合物進(jìn)行低濃度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。發(fā)現(xiàn)濃度為50 μg·mL-1時(shí)，3種化合物均能極顯著抑制黃瓜種子萌發(fā)，且完全抑制胚根生長(zhǎng)。隨著使用濃度的下降各化合物的抑制效果出現(xiàn)明顯差異，當(dāng)濃度為2 μg·mL-1和10 μg·mL-1時(shí)，α-松油醇乙酸萜烯對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響很小，但能完全抑制胚根生長(zhǎng)；10 μg·mL-1的1,8-桉葉素對(duì)光照條件下的種子萌發(fā)，及光照和黑暗條件下胚根生長(zhǎng)的抑制效果顯著，而2 μg·mL-1的影響不明顯；10 μg·mL-1的α-松油醇能100%抑制黃瓜種子萌發(fā)，且濃度低至2 μg·mL-1時(shí)抑制率仍保持22%和32%，可見(jiàn)α-松油醇對(duì)黃瓜生產(chǎn)影響最大。

表4 低濃度α-松油醇乙酸萜烯、1,8-桉葉素和α-松油醇對(duì)黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of low concentration α-terpinol terpene acetate, 1,8-cineole and α-terpinol on seed germination and radicle growth of cucumber

3 結(jié)論與討論

巨尾桉精油共檢出52種化合物，根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分為五大類，其主要成分1,8-桉葉素(41.82%)、α-蒎烯 (39.54%)、α-松油醇乙酸萜烯(6.17%)、α-松油醇(4.33%)和2-茨醇(1.57%)均屬于含氧單萜類和單萜烯類化合物。前人已對(duì)多個(gè)桉樹(shù)品種的葉片精油成分進(jìn)行了分析，李?yuàn)W欣等[19]報(bào)道，尾葉桉精油檢出92種化合物，含量大于1%的有7種，其中最高的3種為1,8-桉油素(64.1%)、α-蒎烯(11.4%)、α-乙酸松油酯(7.9%)；柳桉葉揮發(fā)油檢出42種化合物，含量大于1%的有8種，含量最高的3種為對(duì)傘花烴(24.45%)、α-蒎烯(16.53%)、1，8-桉葉油素(9.16%)[20]；窿緣桉葉精油檢出24種化合物，含量大于1%的有11種，含量排前3的為1，8-桉葉素(38.82%)，α-蒎烯(13.52%)、對(duì)傘花烴(12.04%)[21]。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，不同品種桉樹(shù)葉精油的化合物數(shù)量、主成分種類及含量存在較大差異，但1,8-桉葉素、α-蒎烯作為含量最高的化合物出現(xiàn)在不同的品種中，成為桉樹(shù)葉精油的共同特征。

巨尾桉精油在黑暗條件下對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的抑制作用較光照強(qiáng)，而其主要化合物在光照和黑暗條件下的作用效果差異不明顯。原因可能是精油中不同化合物對(duì)測(cè)試物種的抑制作用差異較大，且抑制作用與其在精油中的含量大小無(wú)直接關(guān)系。本研究中含量為4.33%的α-松油醇處理濃度為2 μg·mL-1時(shí)，在光照和黑暗條件下仍對(duì)黃瓜種子萌發(fā)保持22%和32%抑制率，而含量達(dá)39.54%的α-蒎烯處理濃度為100 μg·mL-1時(shí)，在光照和黑暗條件下的抑制率分別只有7%和13%，含量很低的化合物的抑制作用通過(guò)聚集最終成為影響其他物種生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素。此外，巨尾桉精油在光照和黑暗條件下的作用效果，還與蕓香精油對(duì)蘿卜種子萌發(fā)的抑制作用在光照條件下明顯比黑暗條件下強(qiáng)[17]的結(jié)果存在較大差異，這可能是不同樹(shù)種精油成分及受試物種特性差異所致。

α-蒎烯(39.54%)和1,8-桉葉素(41.82%)為巨尾桉精油中最主要的兩個(gè)化合物，但其對(duì)黃瓜種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響差異較大，無(wú)論是在光照還是在黑暗條件下α-蒎烯的抑制作用均不明顯，而1,8-桉葉素呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，抑制作用隨使用濃度的下降而快速減弱。這與Saban等[22]報(bào)道的單萜烯對(duì)藜麥種子萌發(fā)無(wú)植物毒性作用，及含氧單萜化合物比單萜烯對(duì)種子萌發(fā)具有更強(qiáng)的抑制作用的結(jié)果一致。含氧單萜類化合物α-松油醇和α-松油醇乙酸萜烯均對(duì)黃瓜種子萌發(fā)和生長(zhǎng)表現(xiàn)出了顯著的抑制作用，尤其是α-松油醇，雖然其在精油中含量?jī)H為4.33%，但它在所有被測(cè)試化合物中抑制作用最強(qiáng)，即使?jié)舛冉档? μg·mL-1仍能嚴(yán)重抑制黃瓜種子萌發(fā)和生長(zhǎng)。2-茨醇雖然也是一種含氧單萜化合物，但其抑制作用在所有測(cè)試化合物中最低，這與Despina等[23]報(bào)道的2-茨醇嚴(yán)重抑制農(nóng)作物和雜草的種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)的結(jié)果差異較大?？梢?jiàn)，不同化合物的作用效果不僅與其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，還與被作用的物種有關(guān)。

與種子萌發(fā)相比，巨尾桉精油及其主要化合物對(duì)胚根生長(zhǎng)的抑制作用更為嚴(yán)重，α-松油醇和α-松油醇乙酸萜烯在極低濃度下(2 μg·mL-1)便能完全抑制黃瓜胚根伸長(zhǎng)，而α-蒎烯、1,8-桉葉素和2-茨醇也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用。這與牧草的胚根長(zhǎng)度對(duì)黑芥菜、紫花苜蓿提取物較種子萌發(fā)更敏感[24-25]，與Despina等[23]的結(jié)果相似。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是單萜烯類化合物親脂性好，容易穿透線粒體膜，改變脫氫酶活性，從而損害呼吸代謝[26-27]；如1,8-桉葉素是一種有效的線粒體懸液吸氧抑制劑[28]，因此推測(cè)揮發(fā)油及其單萜類物質(zhì)通過(guò)抑制根系呼吸作用從而影響黃瓜根系發(fā)育[29]。

研究結(jié)果顯示，巨尾桉精油及其主要化合物對(duì)黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的化感作用，而這些精油或其化合物被土壤吸附轉(zhuǎn)運(yùn)后，其抑制活性可保持?jǐn)?shù)月[30]，對(duì)林區(qū)及周邊地區(qū)的農(nóng)業(yè)發(fā)展造成一定制約，因此在巨尾桉生產(chǎn)區(qū)篩選不受其化感物質(zhì)影響的物種具有重要意義。