磷霉素對(duì)萬(wàn)古霉素致大鼠腎損害的保護(hù)作用及機(jī)制研究*

黃麗蓓，楊 斌，黃曉青，林子杰，李潔靜，唐生平，丘 岳△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧 530021）

腎毒性是萬(wàn)古霉素的主要副作用。據(jù)報(bào)道，萬(wàn)古霉素的腎毒性發(fā)生率為5%～25%，聯(lián)用氨基糖苷類藥物可高達(dá)35%。新的治療指南建議，使用高劑量（15～20 mg/L）和長(zhǎng)療程萬(wàn)古霉素治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）導(dǎo)致的復(fù)雜感染，例如菌血癥和醫(yī)院獲得性肺炎，可增加腎損傷（KI）的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。

磷霉素具有廣譜抗菌活性，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌及陰性菌均具有抗菌活性。萬(wàn)古霉素聯(lián)合磷霉素是臨床治療耐藥革蘭陽(yáng)性球菌感染的常用方案。研究顯示，磷霉素通過(guò)干擾體內(nèi)炎癥因子如腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6水平來(lái)調(diào)節(jié)急性期炎癥反應(yīng)[3]。磷霉素對(duì)萬(wàn)古霉素、氨基糖苷類藥物、順鉑等藥物引起的腎功能損害有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚未明確[4-5]。本研究通過(guò)建立萬(wàn)古霉素誘導(dǎo)的KI 大鼠模型，探討磷霉素對(duì)萬(wàn)古霉素KI的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑 注射用鹽酸萬(wàn)古霉素（浙江醫(yī)藥新昌制藥廠）；注射用磷霉素鈉（東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥廠）。丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、肌酐（SCr）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；尿素氮（BUN）試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）；胱抑素C（Cys C）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體重180～220 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）2019-0035。大鼠飼養(yǎng)于溫度（26±1）℃、濕度85%、清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，自由飲水、進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.3 動(dòng)物分組與給藥 將60 只SD 大鼠隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、磷霉素對(duì)照組、KI組、KI+磷霉素低劑量組（KI-L 組）、KI+磷霉素中劑量組（KI-M組）、KI+磷霉素高劑量組（KI-H組），每組10只。KI組腹腔注射200 mg/kg萬(wàn)古霉素建立KI模型。KI-L組、KI-M 組、KI-H 組分別腹腔注射125 mg/kg、250 mg/kg、500 mg/kg 磷霉素，30 min 后腹腔注射200 mg/kg 萬(wàn)古霉素，磷霉素對(duì)照組僅腹腔注射250 mg/kg磷霉素，空白對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)21 d。

1.4 血清Cys C、BUN、Scr 水平測(cè)定 給藥結(jié)束后24 h，稱體重，麻醉，取腹主動(dòng)脈血，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)各組大鼠血清中Cys C、BUN、Scr 水平。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 腎組織病理形態(tài)觀察 取血后處死大鼠，取雙側(cè)腎臟，生理鹽水清洗后稱重，右腎置于-80 ℃冰箱中保存。將左腎置于10%福爾馬林溶液固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片（厚度為5μm），行蘇木精—伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察腎組織病理形態(tài)變化。

1.6 腎組織SOD、NO 和MDA 水平測(cè)定 取右腎組織，用生理鹽水制成10%腎勻漿，取上清液，測(cè)定SOD、NO和MDA水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清Cys C、BUN、Scr 水平比較 與空白對(duì)照組比較，KI組大鼠血清中Cys C、BUN、Scr水平顯著升高（均P＜0.01）；與KI 組比較，KI-L 組和KIM組上述指標(biāo)均顯著降低（P＜0.05）；KI-H組Cys C和Scr水平明顯下降（P＜0.05），但BUN無(wú)明顯差異（P＞0.05）；空白對(duì)照組與磷霉素對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 6組大鼠血清中Cys C、Scr、BUN水平比較，n=10

表1 6組大鼠血清中Cys C、Scr、BUN水平比較，n=10

與空白對(duì)照組比較，##P＜0.01；與KI 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 大鼠腎組織病理形態(tài)比較 HE 染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組大鼠腎小管和腎小球形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)異常病理表現(xiàn)；KI 組大鼠腎小管出現(xiàn)不同程度的變性和壞死，腎間質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重水腫、大量嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，引起腎小管—間質(zhì)性腎炎；各給藥組大鼠腎組織上述形態(tài)均有所改善，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠腎組織HE染色圖（×200）

2.3 大鼠腎組織SOD、NO、MDA水平比較

與空白對(duì)照組比較，KI 組大鼠腎組織NO、MDA 含量顯著升高，SOD 活性降低（均P＜0.01）；與KI組比較，磷霉素各劑量組SOD活性明顯升高，KI-M組和KI-H組NO含量明顯降低，KI-H組MDA含量明顯降低（均P＜0.05），空白對(duì)照組與磷霉素對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 6組大鼠腎組織SOD、NO、MDA水平比較，n＝10

表2 6組大鼠腎組織SOD、NO、MDA水平比較，n＝10

與空白對(duì)照組比較，##P＜0.01；與KI 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 討論

急性KI是由各種原因?qū)е碌哪I單位和間質(zhì)、血管損傷所致，以腎缺血和腎毒性物質(zhì)導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞損傷最為常見(jiàn)。腎毒性物質(zhì)包括外源性和內(nèi)源性毒素。外源性腎毒素以藥物多見(jiàn)。血清Scr、BUN為臨床常規(guī)用于監(jiān)測(cè)腎功能的指標(biāo)，由于腎臟強(qiáng)大的儲(chǔ)備和代償能力，在KI 早期，BUN 和Scr 仍可維持在正常水平。而血Cys C 具有較高的敏感度，且不受個(gè)體生理因素和外在條件的影響，是評(píng)估腎功能變化的良好指標(biāo)。文獻(xiàn)報(bào)道，Cys C可能是評(píng)估萬(wàn)古霉素相關(guān)腎毒性的理想生物標(biāo)志物[6-7]。血清Scr與Cys C聯(lián)合測(cè)定對(duì)早期KI的預(yù)測(cè)有較好的應(yīng)用價(jià)值。

萬(wàn)古霉素在近曲小管細(xì)胞內(nèi)積聚引起細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡是KI發(fā)生的可能機(jī)制之一，其可能通過(guò)間接生成與炎癥相關(guān)的氧自由基，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性及DNA損傷，從而導(dǎo)致腎細(xì)胞損傷。萬(wàn)古霉素可通過(guò)線粒體活性氧的產(chǎn)生和線粒體心磷脂過(guò)氧化誘導(dǎo)豬近端腎小管上皮細(xì)胞凋亡[8-10]。SOD 與MDA 分別為評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激在抗氧化能力和氧化能力方面的重要指標(biāo)，MDA 含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度[11]。本研究中大鼠腎組織SOD活性下降，MDA、NO 含量增多，表明氧化應(yīng)激途徑在萬(wàn)古霉素誘導(dǎo)KI時(shí)被激活。

如何降低萬(wàn)古霉素所致的KI，潛在的策略包括延長(zhǎng)輸液時(shí)間、降低最大濃度、給予抗氧化劑、增強(qiáng)藥物排泄、重組萬(wàn)古霉素改變腎臟清除機(jī)制等[12]?？赡軐?duì)萬(wàn)古霉素致KI有效的藥物包括抗氧化劑、轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（西司他丁、磷霉素）、溶酶體膜穩(wěn)定劑（磷霉素）、自噬抑制劑（氯喹、巴絲霉素A1）、mTOR 激活劑等。Jennifer 等[13]在豚鼠KI 組中發(fā)現(xiàn)，磷霉素可減輕順鉑引起的急性腎小管壞死和間質(zhì)性腎炎。磷霉素可抑制慶大霉素誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)大鼠腎臟溶酶體膜，而對(duì)肝線粒體無(wú)效[14]。本研究中，KI組大鼠血清Cys C、BUN、Scr水平顯著升高，表明成功制作大鼠急性KI 模型；顯微鏡下可見(jiàn)明顯的腎臟病理改變，以腎小管—間質(zhì)性炎癥病變?yōu)橹?。給予磷霉素后，KI 大鼠血清Cys C、Scr、BUN水平均有不同程度地降低，提示磷霉素對(duì)萬(wàn)古霉素所致KI有保護(hù)作用。磷霉素能顯著降低KI大鼠腎組織NO、MDA水平，提高SOD活性，提示磷霉素減輕萬(wàn)古霉素KI 的機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。此外，在本研究中，磷霉素對(duì)照組與空白對(duì)照組腎功能指標(biāo)比較無(wú)明顯差異，表明在正常機(jī)能狀態(tài)下注射磷霉素時(shí)，磷霉素并未對(duì)大鼠的腎功能產(chǎn)生不良影響。

綜上，磷霉素通過(guò)增強(qiáng)大鼠體內(nèi)抗氧化能力，發(fā)揮萬(wàn)古霉素KI 的保護(hù)作用。但本研究尚未就調(diào)控氧化應(yīng)激上游的具體分子機(jī)制進(jìn)行闡述。本課題組擬進(jìn)一步研究Keap1-Nrf2/ARE氧化應(yīng)激信號(hào)通路在萬(wàn)古霉素KI 中的作用及磷霉素的保護(hù)機(jī)制。此外，免疫介導(dǎo)機(jī)制也可能參與了萬(wàn)古霉素誘導(dǎo)的KI，磷霉素也有免疫調(diào)節(jié)作用，免疫機(jī)制在磷霉素對(duì)萬(wàn)古霉素KI 的保護(hù)作用機(jī)制亦值得進(jìn)一步探討。