基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合細(xì)胞和分子實(shí)驗(yàn)探究地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌的潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制*

郭興喆，白先愚，楊萌哲，成南南，徐 寧，周守常，覃柳潔，黃建春，焦愛軍△

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.生命科學(xué)研究院；2.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；3.藥學(xué)院，南寧 530021）

鼻咽癌是一種好發(fā)于鼻咽側(cè)壁和頂部、在我國南方地區(qū)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一[1]，在全世界范圍內(nèi)，超過半數(shù)的鼻咽癌病例都是發(fā)生在中國[2]。我國南部地區(qū)平均發(fā)病率約為3/10 000[3-4]。在鼻咽癌的治療中，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部浸潤是治療難處之所在[5]，需要使用放療化療相聯(lián)合的綜合治療策略[6]?，F(xiàn)階段，需研發(fā)新的化療輔助藥物，以降低治療期間的不良反應(yīng)[7]。

近幾年來，國家政策大力扶持中醫(yī)藥事業(yè)，但目前多以復(fù)方研究為主，因成分復(fù)雜，機(jī)制較難探索，限制了其臨床應(yīng)用及推廣[8]。因此，中藥單體的研發(fā)無疑為抗腫瘤中藥提供了新的出路。大量文獻(xiàn)表明，中藥單體在抗癌作用上有顯著的表現(xiàn)，很大程度上填補(bǔ)了傳統(tǒng)中醫(yī)藥復(fù)方的短板。郭良芬等[9]的研究顯示，采用中藥單體治療鼻咽癌，能顯著減輕放化療的急性毒副反應(yīng)等不良反應(yīng)，提高患者生存質(zhì)量。因此，探尋潛在的抗癌中藥，對(duì)改善臨床療效和提高患者生存質(zhì)量具有重大意義。

地榆皂苷Ⅱ是一種三萜皂苷類化合物，化學(xué)式為C35H56O8，分子量為604.82，外文名稱為Ziyuglycoside Ⅱ，提純于中藥地榆。中藥地榆記載于著作《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有收縮脈管、抗真菌、活血化瘀等作用，在臨床上用于燙傷，炎癥等疾病的治療[10]。有文獻(xiàn)表明，在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435及胃癌細(xì)胞BGC-823中，地榆皂苷Ⅱ可以通過激活線粒體凋亡通路，抑制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抗癌目的[11-12]。在MDA-MB-231 和MCF-7 乳腺癌細(xì)胞株中，地榆皂苷Ⅱ能通過上調(diào)活性氧（ROS），引起細(xì)胞周期阻滯，并通過激活JNK及其相關(guān)下游凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。以上研究表明，地榆皂苷Ⅱ是良好的抗癌中藥單體，但目前在抗鼻咽癌的效果和作用機(jī)制上尚未見報(bào)道。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法來預(yù)測(cè)地榆皂苷Ⅱ?qū)Ρ茄拾┑臐撛诎悬c(diǎn)及相關(guān)通路信息，再通過細(xì)胞和分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從而為臨床研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)

1.1.1 鼻咽癌靶點(diǎn)篩選

通過Pubchem 數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索關(guān)鍵詞“Ziyuglycoside Ⅱ”得到其3D機(jī)構(gòu)，再導(dǎo)入Swisstarget 平臺(tái)（http://www.swisstargetprediction.ch/），可得到相關(guān)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。再通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/）搜索關(guān)鍵詞“鼻咽癌”，得到其相關(guān)靶點(diǎn)。通過韋恩圖繪制在線平臺(tái)（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制鼻咽癌與Ziyuglycoside Ⅱ的靶點(diǎn)交集圖。

1.1.2 PPI（protein-protein interaction）的網(wǎng)絡(luò)可視化構(gòu)建及分析

通過String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）將韋恩圖取交集得到的基因數(shù)據(jù)輸入到String 數(shù)據(jù)庫，通過相關(guān)繪圖軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.3 GO功能富集分析和KEGG pathway通路

通過David 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)鼻咽癌與Ziyuglycoside Ⅱ靶點(diǎn)交集進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析和基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析，得到相關(guān)靶點(diǎn)功能和通路分析。

1.1.4 化合物—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖

收集地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌的交集靶點(diǎn)和KEGG通路富集分析結(jié)果，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建制作“化合物—疾病—靶點(diǎn)—通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 CCK-8 法驗(yàn)證地榆皂苷Ⅱ?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞增殖的抑制作用

采用CCK-8 法測(cè)定地榆皂苷Ⅱ?qū)?-8F 細(xì)胞增殖抑制作用，取狀態(tài)較好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5-8F細(xì)胞，用含0.25%EDTA的胰酶消化，重懸為單細(xì)胞懸液，按照5 000/孔的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，在5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中貼壁12 h，小心地吸出培養(yǎng)液，分別加入含地榆皂苷Ⅱ的培養(yǎng)基100 μL，濃度設(shè)為4 umol/L，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。在5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后，吸出含地榆皂苷Ⅱ的培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，按照CCK-8使用說明書，每孔加入100 μL RPMI-1640 培養(yǎng)基和10 μL CCK-8，于5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育80 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm波長(zhǎng)下各孔的光密度（A），計(jì)算地榆皂苷Ⅱ?qū)?xì)胞的抑制率并繪制細(xì)胞抑制率曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞生存率＝（A 地榆皂苷Ⅱ－A 空白）/（A 對(duì)照－A 空白）

1.2.2 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5-8F細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105/mL 接種于6 孔板，體積為每孔1.5 mL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，4 umol/L 濃度藥物處理細(xì)胞結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，用PBS 緩沖液清洗3 次，再加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞30 min，之后用超聲粉碎細(xì)胞；再將細(xì)胞液放置于低溫離心機(jī)離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液于新的EP 管中，并用BCA 蛋白試劑盒測(cè)定具體蛋白濃度。一定量的蛋白樣品與上樣緩沖液按比例混合后煮沸5 min，SDS-PAGE電泳150 V恒壓70 min，WB濕轉(zhuǎn)（0.45 μm的PVDF膜）270 mA恒流65 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST漂洗3次后分別加入相應(yīng)一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3 次，室溫二抗（1∶5 000）反應(yīng)1 h。用凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳條帶，內(nèi)參作為對(duì)照，計(jì)算各處理組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制預(yù)測(cè)

2.1.1 地榆皂苷Ⅱ潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過PubChem分子庫獲得地榆皂苷Ⅱ的3D結(jié)構(gòu)，見圖1。將3D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入至Swisstarget 平臺(tái)中篩得地榆皂苷Ⅱ靶點(diǎn)，按照Probability排序，選取前10個(gè)基因名稱和靶點(diǎn)，見表1。

表1 地榆皂苷Ⅱ排名前10的潛在靶點(diǎn)

圖1 地榆皂苷Ⅱ的3D結(jié)構(gòu)

2.1.2 地榆皂苷Ⅱ與鼻咽癌相關(guān)的共同靶點(diǎn)

從GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得與鼻咽癌相關(guān)的基因靶點(diǎn)共有1 942個(gè)。100個(gè)藥物靶點(diǎn)基因與1 942個(gè)鼻咽癌相關(guān)基因篩選出共同交集靶點(diǎn)基因38個(gè)，為地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌的潛在靶點(diǎn)基因，見圖2。

圖2 地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌的潛在靶點(diǎn)

2.1.3 地榆皂苷Ⅱ與鼻咽癌相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

PPI網(wǎng)絡(luò)為復(fù)雜疾病構(gòu)建多種蛋白質(zhì)的多因素功能的可視化圖，因此，構(gòu)建了地榆皂苷Ⅱ與鼻咽癌相關(guān)靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。將38 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，獲得地榆皂苷Ⅱ-鼻咽癌靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。

圖3 地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.1.4 GO功能富集注釋

將疾病和藥物交集的38 個(gè)共同靶點(diǎn)通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析，根據(jù)P≤0.01，共篩選出233 個(gè)GO 條目。按照P值升序排列結(jié)果前10條顯著富集的條目，見圖4。結(jié)果表明，涉及內(nèi)肽酶活性、相同蛋白質(zhì)結(jié)合等分子功能；涉及多項(xiàng)生物調(diào)控機(jī)制，包括凋亡過程的負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)水解、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控等生物過程；涉及核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、線粒體等細(xì)胞組成。推測(cè)地榆皂苷Ⅱ治療鼻咽癌可能與內(nèi)肽酶活性、激酶活性、金屬內(nèi)肽酶活性、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控等生物過程。

圖4 地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌GO功能富集分析

2.1.5 KEGG通路富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG通路富集分析，共富集得到77條通路。根據(jù)P值排序，篩選出與鼻咽癌相關(guān)度最高的前19 條通路，見表2。富集結(jié)果顯示在癌癥信號(hào)通路（Pathways in cancer）、PI3KAkt 信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）等通路上富集較多。

表2 地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌KEGG富集結(jié)果

2.1.6 構(gòu)建地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌的“藥物—靶點(diǎn)—疾病—通路”網(wǎng)絡(luò)模型

通過構(gòu)建“藥物—靶點(diǎn)—疾病—通路”網(wǎng)絡(luò)模型圖，可直觀展示地榆皂苷Ⅱ與鼻咽癌交集靶點(diǎn)及通路之間的相互作用關(guān)系及關(guān)聯(lián)程度，見圖5。圖中左側(cè)38 個(gè)黃色節(jié)點(diǎn)代表地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌交集的靶點(diǎn)，根據(jù)節(jié)點(diǎn)的度值按順時(shí)針從大到小的梯度進(jìn)行排列，右側(cè)19個(gè)綠色節(jié)點(diǎn)則對(duì)應(yīng)了KEGG富集結(jié)果中的19條通路，節(jié)點(diǎn)間的連線顯示了通路和靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系，涉及的關(guān)鍵基因包括：AKT1、AKT2、MAPK10、PRKCA、GRB2、JUN、STAT3、MAPK14等。

圖5 “藥物—靶點(diǎn)—疾病—通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 CCK8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

結(jié)果如圖6所示，與對(duì)照組相比較，隨著地榆皂苷Ⅱ濃度的升高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)5-8F細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，作用時(shí)長(zhǎng)為24 h、48 h、72 h的半抑制濃度（IC50）分別為34.47 μmol/L、33.68 μmol/L、19.89 μmol/L。

圖6 地榆皂苷Ⅱ?qū)Ρ茄拾?-8F細(xì)胞增殖的影響

2.2.2 Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)地榆皂苷Ⅱ?qū)I3K和AKT蛋白表達(dá)的影響

Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，100 μmol/L 地榆皂苷Ⅱ?qū)嶒?yàn)組的AKT 和PI3K蛋白表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01），見圖7。

圖7 地榆皂苷Ⅱ?qū)?-8F細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的影響

3 討論

鼻咽癌是一種起病隱逸、前期癥狀不明顯、較難診斷和確診的疾病，雖然放療能大大提高患者生存率，但其帶來的副反應(yīng)也深深地折磨著患者，臨床數(shù)據(jù)顯示，多數(shù)患者在化療后出現(xiàn)口舌干燥、口腔潰瘍、吞咽困難、腦脊髓損傷等諸多副反應(yīng)[14]。因此，這些治療方式具有一定的局限性。

基于中藥單體在腫瘤治療中突出的療效，近些年來對(duì)于中藥單體治療腫瘤的研究顯著增加[15]，尋找能有效治療腫瘤的中藥單體，成為目前的研究熱點(diǎn)和未來的發(fā)展方向。王振龍等[16]相關(guān)研究表示，中藥單體地榆皂苷Ⅱ可激活細(xì)胞凋亡途徑來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，吳澤承等[17]也通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了地榆皂苷Ⅱ可有效抑制人舌鱗癌細(xì)胞CAL27細(xì)胞株的增殖。

本研究分析了地榆皂苷Ⅱ“藥物—靶點(diǎn)—疾病—通路”網(wǎng)絡(luò)模型，結(jié)果顯示，AKT1、AKT2、MAPK10、PRKCA、GRB2 等度值較高，是地榆皂苷Ⅱ治療鼻咽癌的關(guān)鍵潛在靶點(diǎn)基因。再結(jié)合KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，在相關(guān)信號(hào)通路中，PI3KAKT 信號(hào)通路是地榆皂苷Ⅱ作用于鼻咽癌度值最高的關(guān)鍵通路。在PI3K-AKT 途徑當(dāng)中，PIP3 的3位磷酸基團(tuán)可同時(shí)招募AKT 和PDK1 蛋白到細(xì)胞膜上，使PDK1 蛋白將AKT 蛋白上308 號(hào)位的蘇氨酸（T308）磷酸化，致使AKT 蛋白部分活化，從而被活化的AKT 進(jìn)一步調(diào)控激活下游通路。郭金蘭等[18]的研究表明，miR-17-5p 可通過下調(diào)PIK3R1 基因從而靶向激活PI3K/AKT信號(hào)通路抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，說明PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)癌細(xì)胞的增殖和凋亡有重要影響；朱文潔等[19]的研究則表明MiR-1268b 可以靶向下調(diào)ERBB2-PI3K-Akt 通路從而抑制乳腺癌化療的耐藥性，從另一個(gè)角度證實(shí)了可通過下調(diào)PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，達(dá)到干預(yù)癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡；而朱振華等[20]則發(fā)現(xiàn)KIF20A與細(xì)胞周期、凋亡等功能密切相關(guān)，通過在腦膠質(zhì)瘤中下調(diào)KIF20A高表達(dá)后，PI3K/AKT信號(hào)通路被明顯抑制，從而引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)等對(duì)地榆皂苷Ⅱ治療鼻咽癌進(jìn)行了多維度多層次的研究和比較分析，預(yù)測(cè)了地榆皂苷Ⅱ?qū)Ρ茄拾┑淖饔猛凡Ⅱ?yàn)證了其作用機(jī)制，本研究為未來鼻咽癌的臨床治療及實(shí)驗(yàn)研究提供了參考依據(jù)。