中?？Х萕RKY基因家族的生物信息學分析

付春 唐雪 楊瑤君 江納

摘 要：? WRKY轉錄因子是植物信號網絡中不可缺少的部分，作為植物中最大的轉錄因子家族之一，在植物的多種應激反應中發(fā)揮著重要作用。該文利用生物信息學方法對中?？Х萕RKY蛋白家族的理化特性及其分子進化進行了詳細分析。結果表明：（1）CcWRKY蛋白氨基酸數量在103～994個之間，均無信號肽，推測其為非分泌性蛋白;其二級結構以無規(guī)則卷曲為最主要的結構元件，三級結構主要分為6類，其中以CcWRKY15、CcWRKY25、CcWRKY37和CcWRKY42為主要成員的D類結構最穩(wěn)定。（2）保守結構域及進化樹分析結果顯示，中粒咖啡WRKY基因家族含有49個成員，其中的10個成員歸為WRKY第Ⅰ家族，34個成員歸為WRKY第Ⅱ家族，5個成員歸為WRKY第Ⅲ家族。（3）中粒咖啡 WRKY47基因與其他物種的系統(tǒng)進化分析結果顯示，WRKY47與煙草親緣關系最近，與非洲油棕（Elaeis guineensis）親緣關系最遠，說明WRKY47蛋白在生物進化過程中比較保守。該研究結果可為中?？Х萕RKY基因家族分子功能的深層次研究提供一定的借鑒作用，對進一步探究中?？Х萕RKY基因的功能、進化以及分子育種具有重要意義。

關鍵詞： 中?？Х龋?WRKY， 轉錄因子， 系統(tǒng)進化， 生物信息學

中圖分類號：? Q943.2

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2021）11-1905-15

Bioinformatics analysis of WRKY gene family in Coffea canephora

FU Chun1，2*， TANG Xue1，2， YANG Yaojun1，2， JIANG Na 3

（ 1. Bamboo Disease and Pests Control and Resources Development Key Laboratory of Sichuan Province， Leshan Normal University， Leshan

614000， Sichuan， China; 2. College of Life Science， Leshan Normal University， Leshan 614000， Sichuan， China; 3. College of Mathematics and Information Science， Leshan Normal University， Leshan 614000， Sichuan， China ）

Abstract：? WRKY transcription factor is an indispensable part of plant signal network. As one of the largest family of transcription factors in plants， WRKY transcription factor plays an important role in various stress responses of plants. The physicochemical properties and molecular evolution of WRKY protein family of Coffea canephora were analyzed in detail by bioinformatics methods. The results were as follows： （1） The amino acids numbers of WRKY proteins were from 103 to 994， and there was no signal peptide， and were presumed to be a non-secretory protein. Random coil was the most important structural element in the secondary structure of its WRKY proteins. The tertiary structure of WRKY proteins were mainly divided into six categories， among which the D-class structure with CcWRKY15、CcWRKY25、CcWRKY37 and CcWRKY42 as the main members was the most stable. （2） Conserved domain and phylogenetic tree analysis indicated that the WRKY gene family in C. canephora contained 49 members， 10 of which were classified as WRKY class I， 34 members were classified as WRKY class Ⅱ， and 5 members were classified as WRKY class Ⅲ. （3） The phylogenetic analysis of WRKY47 gene of C. canephora and other species showed that WRKY47 of C. canephora was the most closely related to tobacco and the most distant to Elaeis guineensis， indicating that WRKY47 protein is relatively conservative in the process of biological evolution. The results of this study can provide some reference for the further study of the molecular function of WRKY gene family of C. canephora， and have important practical significance for further exploration of the function， evolution and molecular breeding of WRKY gene in C. canephora.

Key words： Coffea canephora， WRKY， transcription factor， phylogenetic evolution， bioinformatics

中?？Х龋–offea canephora）的年平均產量和產值均居三大飲料作物之首，其消費量也位居第一（閆林等，2018）。它作為一種重要的提神飲料已有成百上千年的歷史，是國際貿易中非常重要的原料產品（Monente et al.， 2015）。中?？Х仁菍儆谲绮菘瓶Х葘俚囊环N小喬木或灌木，咖啡屬植物共100多種，而生產性栽培的主要為小粒種和中粒種，分別占世界咖啡產量的60%和40%。2014年，海南以種植中粒種咖啡為主，咖啡種植面積占全國的0.47% （Rodrigues et al.， 2015; 閆林等，2018）。雖然中粒種咖啡理想的種植環(huán)境是在氣溫高、降雨量豐沛的地方，但在栽培過程中經常會遭遇病害、干旱和低溫等脅迫，嚴重影響了其生長發(fā)育，從而給生產帶來重大損失（楊華庚，2014）。

植物中WRKY蛋白是一種普遍存在的基因超家族轉錄因子，是植物科學研究中最多的一種轉錄因子，歸屬于高等植物的10大超家族轉錄因子（鄭超等，2018）。WRKY因其家族所有成員的N端均含有由WRKYGQK 7個氨基酸組成的保守序列而得名，依據其特點將植物中的WRKY基因超家族（李智等，2019）劃分為3個家族，即I、Ⅱ、Ⅲ家族（鄭超等，2018）。I家族具有2個WRKY域和1個鋅指結構為C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H） （其中X可以表示任一氨基酸）;Ⅱ家族由1個WRKY域和1個以C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）為代表的鋅指結構域組成;Ⅲ家族由1個WRKY域和C2HC型鋅指結構（C-X7-C-X23-H-X1-C）組成（Bakshi et al.， 2014）。Ishiguro & Nakamura（1994）首次在甘薯（Ipomoea batatas）中克隆出首個WRKY基因并鑒定了1個DNA binding蛋白，命名為SPF1轉錄因子。隨后，在不同作物中克隆和鑒定到大量的WRKY轉錄因子，包括蓖麻（56個WRKY基因）（鄒智，2013）、獼猴桃（89個WRKY基因）（包昌艷等，2018）、番茄（81個WRKY基因）（張紅，2017）、葡萄（56個WRKY基因）（蘇玲等，2019）和棗（92個WRKY基因）（薛寶平等，2018）等。

WRKY轉錄因子是一類植物特有的轉錄因子，參與植物種子解除休眠、代謝和激素信號轉導等調控（謝政文等，2016），在很多植物的發(fā)育和生理過程中具有轉錄激活或轉錄抑制的功能（Rushton et al.， 2012; Ding et al.， 2015）。有研究分析指出，WRKY基因家族在鹽脅迫、高溫、低溫和干旱等應答非生物脅迫條件下起到了非常重要的作用（Wu et al.， 2009; 李曉穎等，2019）。也有研究報道，WRKY轉錄因子在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用，如果實成熟（Xu et al.， 2004）、胚胎發(fā)育（Lagacé et al.， 2004）和衰老（Robatzek et al.， 2010; 張柳等，2019）等。包昌艷等（2018）發(fā)現在獼猴桃中有33個WRKY基因在植物根、葉、花和果4個器官中均有顯著性表達;張柳等（2019）在蘋果WRKY基因家族研究中發(fā)現有12個MdWRKY均在根、莖、葉、花和果中表達，表明MdWRKY可能參與調控蘋果生長和發(fā)育等過程;谷彥冰等（2015）在煙草‘云煙87’葉片衰老WRKY轉錄因子研究中指出，NtWRKY11、NtWRKY31、NtWRKY40和NtWRKY51與逆境脅迫相關，且在葉片衰老中起到交叉作用。到目前為止，在中粒咖啡轉錄因子中，雖然對TPS基因家族進行了系統(tǒng)分析（程甜等，2016），但對WRKY基因家族研究甚少。Dong et al.（2019）對中粒咖啡全基因組鑒定了49個CcWRKYs，并研究了其對寒冷脅迫的響應。本研究將通過生物信息學的方法對中粒咖啡WRKY轉錄因子的氨基酸組成、跨膜結構域、保守基序、蛋白的高級結構分析以及與煙草、獼猴桃、水稻等物種的親緣關系進行預測和分析，為進一步研究與生物逆境相關的WRKY轉錄因子的功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

從植物轉錄因子數據庫（版本為V5.0）（http：//planttfdb.gao-lab.org/index.php）獲取中?？Х龋–offea canephora）、水稻（Oryza sativa subsp. indica）、玉米（Zea mays）、獼猴桃（Actinidia chinensis）、煙草（Nicotiana tabacum）、板栗（Castanea mollissima）、非洲油棕（Elaeis guineensis）、小果野蕉（Musa acuminata）、毛竹（Phyllostachys heterocycla）、棗（Ziziphus jujuba）、蘋果（Malus domestica）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）12個物種的WRKY轉錄因子家族的核苷酸序列及氨基酸序列。通過Blastp程序比對擬南芥WRKY蛋白序列找出中?？Х绒D錄因子WRKY（CcWRKY）基因家族成員的對應關系（表1）。

1.2 方法

1.2.1 WRKY家族成員編碼蛋白理化性質分析 運用PrtoParam在線程序分析了CcWRKY蛋白的理化性質，包括氨基酸長度、總平均親疏水性及帶正負電荷氨基酸數量等指標的相關預測。利用在線軟件SignalP-5.0和CELLO v2.5（Yu et al.， 2006; 沙桐等，2019）分別對49條中粒咖啡WRKY基因家族的氨基酸序列進行信號肽預測和亞細胞定位分析。

1.2.2 氨基酸的跨膜結構、親疏水性、磷酸化位點及保守基序預測 在TMHMM Server v.2.0在線軟件中（周潔和黃婧，2018）輸入中?？Х萕RKY蛋白序列，分析該蛋白家族的跨膜結構。通過Protscale在線網站完成其親疏水性預測分析。通過NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對中?？Х萕RKY蛋白序列潛在磷酸化位點進行預測分析。利用MEME 5.0.4在線工具搜索中粒咖啡WRKY基因家族成員的Motif，參數設置為保守基序個數為10，其他參數為默認設置。

1.2.3 蛋白質的二級結構和三級結構預測 利用SOPMA在線網站預測分析了中?？Х?9種WRKY蛋白的二級結構（張春蘭等，2018）。利用Phyre 2（Kelley et al.， 2015）網站對49種WRKY蛋白的三級結構進行預測分析。

1.2.4 中?？Х萕RKY基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 利用MEGA 7.0軟件（王鵬洋等，2019）對CcWRKY蛋白序列進行多重比對并構建其系統(tǒng)發(fā)育樹，對中?？Х?、擬南芥、煙草、獼猴桃、板栗、蘋果和玉米等12個物種的WRKY1蛋白序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹（Kumar et al.， 2018），對生成的系統(tǒng)發(fā)育樹進行校正，校驗參數Bootstrap重復1 000次，得到最終的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 中?？Х萕RKY蛋白一級結構和理化特性

運用在線程序PrtoParam（沙桐等，2019）搜索出中?？Х绒D錄因子WRKY基因家族共49個成員，將這些成員的蛋白一級結構和理化性質進行匯總及分析，結果顯示中?？Х萕RKY基因家族蛋白的氨基酸總數在103～994個之間，氨基酸平均為376個;多數為酸性蛋白質，只有19個成員的理論等電點大于8.0;不穩(wěn)定系數顯示Cc02_g05280和Cc10_g06400為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數小于40的為穩(wěn)定蛋白）。有3個成員的帶負電荷的殘基總數等于帶正電荷的殘基總數，分別是Cc01_g14950和Cc07_g03120，顯示電中性;有25個成員的帶負電荷的殘基總數大于帶正電荷的殘基總數，顯示帶負電荷;有21個成員帶正電荷的殘基總數大于帶負電荷的殘基總數，顯示帶正電荷（表1）。

根據這些成員的氨基酸組成進行分析比較，結果顯示有44個成員含量最高的氨基酸為絲氨酸，含量在7.5%～16.6%之間（圖1：a，b，c）。其中，有2個成員（Cc02_g38600和Cc03_g00670）含量最高的氨基酸為脯氨酸（圖1：d，e），1個成員（Cc05_g04000）含量最高的氨基酸為天冬酰胺（圖1：f），1個成員（Cc09_g01430）含量最高的氨基酸為丙氨酸（圖1：g），1個成員（Cc10_g06400）含量最高的氨基酸為賴氨酸（圖1：h）。

2.2 氨基酸的親疏水性預測

借助在線工具Protscale對該蛋白進行親疏水性預測分析，從總體分布來看，這些轉錄因子氨基酸的分值均為負值，表明它們都是親水性蛋白。由此看出49種WRKY的平均疏水系數介于-1.196～-0.473之間，表明其都是親水性蛋白。最大疏水性數值范圍在0.589～2.789之間，最大的是Cc07_g03730成員，最小的是Cc08_g11060成員;最小疏水性數值范圍在-3.967～-2.511之間，最大的是Cc02_g05280成員，最小的是Cc06_g03470和Cc08_g15270成員。其中，Cc08_g11060的平均疏水系數最小，說明其親水性最強，它的最大疏水性位置是第170個，值為0.589，最小疏水性位置是第104個，值為-3.811（表2）。

2.3 信號肽預測及亞細胞定位結果

這49個WRKY蛋白均無信號肽，推測其為非分泌性蛋白。分別對49種WRKY蛋白進行了亞細胞定位預測，這些家族成員的亞細胞定位，都位于細胞核（表1），說明CcWRKY家族成員蛋白亞細胞定位于細胞核。

2.4 編碼氨基酸的跨膜結構分析

采用TMHMM Server v.2.0在線程序（鄭超等，2018）分析中?？Х萕RKY蛋白的跨膜結構，結果顯示WRKY中僅1個成員Cc02_g22190蛋白質序列的第536個到第553個氨基酸之間有1個明顯跨膜區(qū)域（圖2），其余的48個成員都無跨膜區(qū)域，推斷中粒咖啡WRKY不屬于跨膜蛋白。

2.5 磷酸化位點分析

經分析發(fā)現，這49種WRKY蛋白中絲氨酸磷酸化位點數量最多，其次是蘇氨酸和酪氨酸。最有可能是潛在磷酸化位點的氨基酸是絲氨酸，其最小值達0.849，遠遠超過標準值0.5。這說明CcWRKY基因家族蛋白可能通過相應位點的磷酸化來實現其功能的調控。其中，Cc07_g03730成員的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點數量最多，分別有83個、39個和12個（表3）。

2.6 編碼蛋白的二級、三級結構預測分析

蛋白質的二級結構主要是指蛋白質的多肽鏈中有規(guī)則重復的構象，從CcWRKY家族成員的蛋白二級結構分析可以看出，CcWRKY基因家族的二級結構主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、β-轉角和延伸鏈組成，這4種蛋白質的二級結構元件通常為主要研究對象（張春蘭等，2018），通過預測和數據分析更易了解蛋白的空間結構。其中，無規(guī)則卷曲所占比例較高，介于45.73%～77.26%之間，其主要功能為連接其他二級結構元件，β-轉角在二級結構中占比均較小。CcWRKY基因家族的二級結構較整齊，除Cc00_g06830、Cc05_g14660、Cc07_g16400、Cc08_g11060和Cc10_g06400是無規(guī)則卷曲>延伸鏈>α-螺旋>β-轉角外，其余基因家族成員均是無規(guī)則卷曲>α-螺旋>延伸鏈>β-轉角（表4，圖3）。

從圖4分析發(fā)現，中粒咖啡WRKY轉錄因子基因家族蛋白的三級結構可以分為6類，分別以A、B、C、D、E和F表示。其中，D類成員最多，有25個;其次是A類，有9個成員;E類含有7個成員，B類含有4個成員，C類含有3個成員;最少的是F類，只有1個成員。從三級結構穩(wěn)定性來看，結構穩(wěn)定從強到弱的順序為F>D、E>A>C>B。其中，Cc07_g03730以c5yvfD結構為模板，有315個氨基酸殘基與模板達到100%的可信度;Cc05_g08580以c2aydA結構為模板，有75個氨基酸殘基與模板達到100%的可信度。

2.7 氨基酸序列的保守基序分析

借助MEME在線工具搜索中?？Х萕RKY基因家族成員的Motif，根據其保守性的強弱，依次命名為Motif1-Motif6。從序列l(wèi)ogo可以看出，WRKYGQK七肽序列的基序分別存在于Motif1和Motif5中，WRKY基因家族49個成員均具有Motif1和Motif2，推測Motif1是WRKY結構域。每個成員至少都含有1個WRKY七肽，其中最多的有5個保守基序，最少的有2個保守基序。有19個成員只有Motif1和Motif2;有7個成員含有Motif1、Motif2、Motif4、Motif5和Motif6（圖5，表5）。

2.8 中?？Х萕RKY蛋白的分子進化分析

對WRKY基因家族成員蛋白序列進行多重比對分析，將下載的49個家族成員蛋白序列輸入MEGA，并繪制出中粒咖啡WRKY蛋白的進化樹（圖6）。從進化樹的聚類結果可以清晰地看出，這49個成員分成了6組（依次稱為Group 1、Group 2、Group 3、Group 4、Group 5和Group 6）。其中，Group 1成員最多[14個，CcWRKY09，CcWRKY11，CcWRKY13，CcWRKY18，CcWRKY24，CcWRKY28，CcWRKY29，CcWRKY33，CcWRKY35，CcWRKY40，CcWRKY41， CcWRKY43，CcWRKY44和CcWRKY46]，約占總數的28.4%;其次是Group 2? [10個， CcWRKY01，CcWRKY19，CcWRKY20，CcWRKY22，CcWRKY23，CcWRKY26，CcWRKY38，CcWRKY45，CcWRKY47和CcWRKY48]、Group 5? [10個， CcWRKY02，CcWRKY04，CcWRKY07，CcWRKY10，CcWRKY17，CcWRKY27，CcWRKY30，CcWRKY34，CcWRKY39和CcWRKY42]和Group 3? [9個， CcWRKY08，CcWRKY14，CcWRKY15，CcWRKY16，CcWRKY25，CcWRKY31，CcWRKY32，CcWRKY37和CcWRKY49];剩余2組成員均較少，Group 6有5個 [CcWRKY3，CcWRKY5，CcWRKY6，CcWRKY12和CcWRKY36]，Group 4僅有1個（CcWRKY21） （表1）。從進化樹分支關系可以得出，Group 1、Group 2、Group 3、Group 4和Group 5聚類為一大組，說明它們的親緣關系較近，而Group 6與它們的關系較遠。因此，推測Group 6成員可能是在物種長期遺傳進化過程中非常保守，且與祖先關系最相似的一類而被保留下來的。

分析進化樹分組結果后，采取家族成員分組比對的方法，發(fā)現每組的保守氨基酸呈現多樣性。值得注意的是所有組都具有WRKY保守基序，參考Eulgem et al.（2000）分類標準，將得到的49個WRKY基因家族成員分為3類：Group 2 （D731-H785、D943-H998）屬于WRKY第Ⅰ家族，含有2個保守的七肽結構（WRKYGQK）和2個鋅指結構（C2H2型）;Group 6 （D151-C209）屬于WRKY第Ⅲ家族，含有1個保守的七肽結構（WRKYGQK）和1個鋅指結構（C2HC型）（巴德仁貴等，2017）;Group 1 （D205-H260）、Group 3 （D359-H415）、Group 4 （D151-H206）、Group 5 （D218-H274或P316-H374）含有1個保守的WRKY結構域和1個C2H2鋅指型結構域，被歸為WRKY第Ⅱ家族（圖7）。

2.9 中粒咖啡轉錄因子WRKY與其他物種間的系統(tǒng)進化分析

使用MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)生樹的構建，進化樹結果顯示，中?？Х扰c11個物種的WRKY47轉錄因子家族成員可分為2個分支，即煙草、中?？Х取J猴桃、擬南芥、板栗、棗和蘋果在第1個分支，而玉米、水稻、毛竹、小果野蕉、非洲油棕在第2個分支。在第1個分支內，中?？Х萕RKY47與煙草親緣關系最近，序列同源性最高，其次與獼猴桃親緣關系較近，與非洲油棕親緣關系最遠。從雙子葉角度來看，中?？Х扰c獼猴桃、煙草、擬南芥、板栗、棗和蘋果這些植物聚類在一大類，符合雙子葉分類標準，而單子葉玉米、水稻、毛竹、小果野蕉和非洲油棕聚類在另一大類，表明雙子葉和單子葉植物遺傳進化具有很明顯的分界線。從喬本類植物的角度來看，中?？Х萕RKY47與獼猴桃的親緣關系最近，與非洲油棕關系最遠;從草本類植物來看，中?？Х萕RKY47與煙草的親緣關系最近，與水稻關系最遠（圖8）。

3 討論與結論

WRKY轉錄因子在植物界中通過其保守的氨基酸序列（WRKYGQK）特異識別靶基因的啟動子區(qū)域W-box? [（T）TGACC（AT）]，且調控靶基因的轉錄表達（梁濱和董冬，2018）。成功鑒定和挖掘了AtWRKY和OsWRKY基因家族的生物學特征和分子功能（谷彥冰等，2015）。WRKY基因家族在種子萌發(fā)過程、植物防衛(wèi)應答反應、代謝調控和發(fā)育衰老調控等生命過程中都起到重要作用（梁濱和董冬，2018）。在擬南芥WRKY抗病轉錄因子研究中，發(fā)現WRKY家族因子能在一定程度上提高耐受低磷脅迫的能力，對腐生病原菌起正調控作用的為AtWRKY3和AtWRKY4（Lai et al.， 2008; 陳益芳等，2010）。在煙草植物應答病毒侵染過程研究中，推斷NtWRKY40可能是參與機械損傷脅迫和病原菌侵染的重要組分（劉晶晶等，2016）。張計育等（2015）在獼猴桃澇害脅迫研究中指出，WRKY在獼猴桃對澇害脅迫反應起到重要作用。付冰等（2018）在研究棗WRKY轉錄因子對棗瘋病植原體和激素處理的應答中，指出棗瘋病植原體侵染棗樹后，誘導了ZjWRKY8、ZjWRKY52、ZjWRKY61和ZjWRKY69基因的表達。許海峰等（2018）對蘋果的鹽脅迫研究發(fā)現，MdWRKY18和MdWRKY40受鹽脅迫的誘導，可形成同源或異源二聚體，并增強對鹽脅迫的耐性?？傊琖RKY轉錄因子在直接參與植物的生命活動中具有關鍵作用（Gao et al.， 2016）。

本研究發(fā)現中?？Х萕RKY蛋白家族的氨基酸總數在103～994個之間，氨基酸平均為376個，等電點范圍為5.03～9.62。這與同源性較高的棗（薛寶平等，2018）、蘋果（Bhattarai， 2010）WRKY轉錄因子研究的結果相似。本研究還發(fā)現中?？Х萕RKY蛋白家族都是不含跨膜結構域的親水性穩(wěn)定蛋白，都無信號肽，亞細胞定位都在細胞核中，說明該蛋白是在細胞內合成后運輸到細胞核后起作用;WRKY蛋白在絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸處都有磷酸化位點，推測該蛋白是通過磷酸化來實現其功能的調控;49種WRKY轉錄因子的二級結構均主要以無規(guī)則卷曲為主，三級結構可以分為6類，其中以D類為主。Robatzek et al.（2002）研究表明，AtWRKY61有可能參與植物免疫信號通路;通過與AtWRKY72共同參與植物的抗病信號通路（Bhattarai， 2010）;擬南芥中WRKY6參與到植物防衛(wèi)反應及葉片的衰老過程中（Robatzek et al.， 2002）;AtWRKY7參與了擬南芥的天然免疫反應（Journot-Catalino et al.， 2006）。從本研究中?？Х萕RKY蛋白的三級結構來看，D類比較穩(wěn)定，D類中有與AtWRKY61、AtWRKY72、AtWRKY6和AtWRKY7的對應關系，推測中?？Х萕RKY可能參與植物免疫、植物抗病信號通路，也可能參與到植物防衛(wèi)反應及葉片的衰老與天然免疫反應的過程中。本研究從保守結構域預測分析可以看出，Cc00_g01860、Cc00_g05270、Cc00_g05280、Cc00_g39120和Cc08_g15910，5個成員保守基序只含有2個，分別為Motif1與Motif2，可將它們分為1個大類，這與WRKY蛋白構建進化樹的結果是一致的，這些成員都在Group 6。WRKY結構域既包含保守的七肽結構（WRKYGQK），又包含1個鋅指結構（C2HC），并且C2HC結構只存在第Ⅲ家族的WRKY結構域（李曉穎等，2019），這與在棗（薛寶平等，2018）等其他物種上的研究結果相似。本研究中，中粒咖啡WRKY轉錄因子家族蛋白序列可以分為6組，從中粒咖啡WRKY47基因與煙草、獼猴桃和擬南芥等11種物種構建的系統(tǒng)進化樹可以得到中粒咖啡WRKY47與煙草親緣關系最近，序列同源性也較高，與非洲油棕親緣關系最遠。

本研究在中?？Х然蚪M中發(fā)現49個WRKY基因，對該家族基因編碼蛋白的理化性質、磷酸化位點、跨膜結構、二級和三級結構、功能結構域和分子進化等進行了詳細的生物信息學分析，為后續(xù)研究中?？Х萕RKY分子功能、進化起源關系及其逆境脅迫機制提供了理論依據。

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（責任編輯 蔣巧媛）