2株拮抗放線菌復(fù)合防治番茄青枯病的研究

賴寶春，姚錦愛，戴瑞卿，吳振強(qiáng)，王家瑞

（1. 福建省漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，漳州 363005；2. 福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福州 350013）

由茄科勞爾氏菌Ralstonia solanacearum引起的番茄青枯病是一種世界范圍的細(xì)菌性維管束病害，能侵染 200多種植物，包括茄科農(nóng)作物和觀賞類植物[1]。生產(chǎn)上防控該病的方法主要有施用化學(xué)農(nóng)藥[2]、選育抗病品種[3]、嫁接或輪作[4]、土壤改良[5]等，但都存在明顯的弊端。近年來(lái)，拮抗微生物菌劑因其高效、生態(tài)安全、成本低、專一性強(qiáng)且能促進(jìn)植株生長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)已成為植物青枯病生物防治的首選。已篩選出的微生物菌劑包括單一菌劑和復(fù)合菌劑。單一菌劑主要有芽胞桿菌[6,7]、無(wú)致病力青枯雷爾氏菌[8]、假單孢菌[9]、鏈霉菌[10,11]等。但考慮到青枯病菌是一種破壞性極強(qiáng)的土傳細(xì)菌，在土壤、水和植物中存活時(shí)間長(zhǎng)，單一菌劑防效不理想，存在諸如持效性差，環(huán)境依賴性強(qiáng)等，難以達(dá)到理想的防治效果[12]。而復(fù)合菌劑具有提高生物防治效果及延長(zhǎng)生防菌作用期限等優(yōu)點(diǎn)，已成為新的研究熱點(diǎn)，目前有關(guān)利用復(fù)合菌劑防治青枯病的報(bào)道多集中于生防細(xì)菌的復(fù)配，王麗麗等[13]將健康番茄根際分離到的2株芽胞桿菌混合后，對(duì)番茄青枯病的防治效果明顯優(yōu)于單一菌株。李程等[14]將2株解淀粉芽胞桿菌ZM9和YH-22復(fù)合后對(duì)煙草青枯病菌的抑菌圈直徑顯著大于單一菌株處理。呂建林等[15]將短短芽胞桿菌B011和側(cè)孢芽胞桿菌2-Q-9混合后對(duì)煙草青枯病的防效優(yōu)于單一菌株，達(dá) 83.39%。黃小琴等[16]用解淀粉芽胞桿菌和硫酸鏈霉素混配后，對(duì)煙草青枯病的防效達(dá)65.85%，且能減少一半化學(xué)農(nóng)藥的施用量。因此，通過(guò)復(fù)合菌劑來(lái)提高番茄青枯病的防治效果顯得尤為重要。

有關(guān)生防放線菌復(fù)合防治番茄青枯病的研究較少。而放線菌中應(yīng)用最多的是鏈霉菌，鏈霉菌已被報(bào)道應(yīng)用于防治多種植物的青枯病，還能促進(jìn)植株生長(zhǎng)[17,18]。鏈霉菌的代謝產(chǎn)物能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，如豐加霉素、環(huán)二肽、四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素等[19,20]。且生產(chǎn)上應(yīng)用的諾爾霉素、水合霉素、中生菌素等農(nóng)用抗生素對(duì)番茄青枯病均具有良好的防治效果[21]。Amano等[22]、Smaoui等[23]報(bào)道的灰銹赤鏈霉菌能產(chǎn)多種抗生素及抗真菌純化合物。Wadetwar等[24]、包慧芳等[25]報(bào)道的深紅紫鏈霉菌除了能產(chǎn)生胞外抗生素，還具有α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶的活性。因此，探索鏈霉菌復(fù)合防控番茄青枯病具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究的生防菌株灰銹赤鏈霉菌（FX81）和深紅紫鏈霉菌（FX28）前期已證實(shí)對(duì)土傳病原真菌鐮刀菌具有良好的抑制作用，抑菌譜廣，且能致真菌菌絲畸變，具強(qiáng)烈抑制病菌孢子萌發(fā)的能力[26-28]。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)這2株放線菌對(duì)土傳病原細(xì)菌的抑制作用，我們進(jìn)行了單菌株對(duì)番茄青枯病菌的皿內(nèi)初篩后，發(fā)現(xiàn)這2株放線菌均對(duì)番茄青枯病菌有較強(qiáng)的抑制作用。因此，本研究從生防放線菌多菌復(fù)合協(xié)同增效的角度出發(fā)，研究2株拮抗放線菌復(fù)合對(duì)番茄青枯病的防治效果及其對(duì)番茄植株的促生作用，以期為番茄青枯病微生物菌肥的開發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試拮抗放線菌：灰銹赤鏈霉菌Streptomyces griseorubiginosus（FX81）和深紅紫鏈霉菌Streptomyces violaceorubidus（FX28）菌株，均由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植物保護(hù)研究室篩選保藏。

供試病原菌：番茄青枯病菌R. solanacearum（QK1）由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植物保護(hù)研究室分離、鑒定、保藏。

試驗(yàn)番茄品種：“西研958”（西安秦蔬農(nóng)業(yè)有限公司），由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所蔬菜研究室提供。

1.2 拮抗菌株間親和性的測(cè)定

將100 mL高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基加入250 mL的三角瓶中，121 ℃高壓滅菌30 min，待冷卻后分別單獨(dú)接入菌株FX81和FX28的5 mm菌餅各5塊，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，制成1.0×108cfu/mL菌株發(fā)酵液備用；采用對(duì)峙培養(yǎng)法將2株菌株的發(fā)酵液交叉滴于同一個(gè)高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，重復(fù)3次。28 ℃對(duì)峙培養(yǎng)5～7 d，觀察2株菌株的生長(zhǎng)情況及相互之間有無(wú)拮抗作用。

1.3 單一及復(fù)合拮抗菌離體抑菌作用測(cè)定

按1.2的方法同時(shí)接入菌株FX81和FX28的5 mm菌餅各3塊，制成1.0×108cfu/mL的復(fù)合發(fā)酵液備用。采用杯碟法。將培養(yǎng)好的番茄青枯菌液100 μL（濃度為3.0×106cfu/mL）與培養(yǎng)基混勻后倒入放置牛津杯的平板，待凝固后取出牛津杯，在孔中加入200 μL的待測(cè)單一或復(fù)合拮抗菌的發(fā)酵液，培養(yǎng)48 h后測(cè)定透明抑菌圈的大小[29]。

1.4 單一及復(fù)合菌劑對(duì)番茄青枯病的防治效果

1.4.1 單一及復(fù)合菌劑的制備 單一及復(fù)合固體發(fā)酵基質(zhì)配方及固體菌劑發(fā)酵參考賴寶春等[26]的方法制備。即將優(yōu)化好的豬糞與麥麩質(zhì)量比為4:6裝入250 mL三角瓶中，每瓶加發(fā)酵原料總量20 g，控制料水比為1:0.8，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.5，121 ℃滅菌20 min，即為固體發(fā)酵基質(zhì)（命名為GC）。按15%接種量接入單一及復(fù)合發(fā)酵液，28 ℃恒溫培養(yǎng)，待瓶壁及固體培養(yǎng)基中長(zhǎng)滿菌絲，并散發(fā)出典型的“土腥味”，即完成單一及復(fù)合固體菌劑發(fā)酵，分別命名為BOF28、BOF81、BOF8128，菌劑中拮抗菌的含量達(dá)到108cfu/g。1.4.2 盆栽防治效果測(cè)定 番茄種子催芽后播種于穴盤，待番茄幼苗長(zhǎng)至12 cm時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄幼苗移栽到花盆（直徑25 cm）中，每盆1株苗，試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理，分別為CK1（空白對(duì)照）、CK2（與固體發(fā)酵基質(zhì)相當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)化肥對(duì)照）、GC（固體發(fā)酵基質(zhì)）、BOF81（含F(xiàn)X81菌株的菌劑）、BOF28（含F(xiàn)X28菌株的菌劑）、BOF8128（含2株菌比例為1:1的復(fù)合菌劑），固體發(fā)酵基質(zhì)和固體菌劑用量為2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），與土壤混勻。每個(gè)處理10盆，3次重復(fù)。處理7 d后，每盆根部接種青枯菌液5 mL（濃度為3.0×106cfu/mL），接種45 d后采集各處理的根際土樣，利用SMSA培養(yǎng)基平板稀釋涂布法計(jì)數(shù)青枯病菌的數(shù)量[30]；并調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)，計(jì)算防治效果，病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照王麗麗等[13]的方法。發(fā)病率（%）＝發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100，病情指數(shù)＝Σ（病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù)）/（最大病級(jí)數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對(duì)照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100。

1.4.3 生物量的測(cè)定 按1.4.2的方法播種、移栽和管理，45 d后將各處理的健康番茄植株連根拔起帶回實(shí)驗(yàn)室，將植株地上部洗凈后裝入大牛皮紙袋中，105 ℃殺青0.5 h后，80 ℃烘至恒質(zhì)量，測(cè)定植株干質(zhì)量，分析生防放線菌復(fù)合菌劑對(duì)番茄植株的促生作用。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用DPS 7.5軟件進(jìn)行分析，Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 2株拮抗放線菌親和性的測(cè)定

將菌株FX81和FX28在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，可見2株菌株之間能夠重疊生長(zhǎng)，菌落之間未觀察到明顯的抑菌帶，即表明2株菌株之間無(wú)明顯抑制作用，可以進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵或?qū)⒕哼M(jìn)行復(fù)配（圖1）。

圖1 菌株FX81和FX28的共培養(yǎng)Fig. 1 Co-culture of FX81 and FX28

2.2 單一及復(fù)合拮抗菌株對(duì)番茄青枯病菌的抑制作用

2株放線菌單一菌株或復(fù)合菌株發(fā)酵液對(duì)番茄青枯病菌均有較強(qiáng)的抑制作用，菌株FX81單一發(fā)酵液抑菌圈平均直徑為（27.0±0.43）mm（圖2B），菌株FX28單一發(fā)酵液抑菌圈平均直徑為（28.8±0.62）mm（圖2C），復(fù)合拮抗菌發(fā)酵液抑菌圈平均直徑達(dá)（36.0±0.46）mm（圖2D）。結(jié)果表明，拮抗放線菌復(fù)合發(fā)酵液處理組對(duì)番茄青枯病菌的抑菌效果優(yōu)于單一菌株處理組，說(shuō)明2株放線菌對(duì)番茄青枯病菌具有的協(xié)同抑制作用。

圖2 單一菌株及復(fù)合菌株對(duì)番茄青枯病菌的拮抗效果Fig. 2 Inhibitory effect of strain single and compound against R. solanacearum

2.3 單一及復(fù)合菌劑對(duì)番茄青枯病的防治效果

2.3.1 單一及復(fù)合菌劑對(duì)番茄生物量的影響 從表1可以看出，單施固體發(fā)酵基質(zhì)（GC）與常規(guī)化肥對(duì)照（CK2）相比無(wú)明顯促生效果，各菌劑處理可顯著提高番茄地上部干質(zhì)量，施用單一菌劑BOF81和BOF28番茄地上部干質(zhì)量分別比空白對(duì)照（CK1）增加54.49%和46.51%；施用復(fù)合菌劑BOF8128對(duì)番茄生物量影響最顯著，與空白對(duì)照（CK1）相比增加76.58%，與單一菌劑BOF81和BOF28相比，分別增加14.31%和20.52%。說(shuō)明復(fù)合菌劑BOF8128在促進(jìn)番茄地上部分生長(zhǎng)方面顯著優(yōu)于單一菌劑。

表1 單一及復(fù)合菌劑對(duì)番茄地上部干質(zhì)量的影響Table 1 Effects of single and compound microbial agents on dry weight of tomato shoot

2.3.2 單一及復(fù)合菌劑對(duì)番茄根際病原菌數(shù)量的影響 從圖3結(jié)果可以看出，菌劑可顯著影響番茄根際青枯菌的數(shù)量，接種青枯菌45 d后，空白對(duì)照（CK1）青枯菌的數(shù)量達(dá)1.7×108cfu/g，顯著高于菌劑處理。施用單一菌劑BOF81和BOF28青枯菌數(shù)量分別為1.4×107cfu/g和1.9×107cfu/g，與空白對(duì)照（CK1）相比，青枯病菌數(shù)量增長(zhǎng)較緩慢。而施用復(fù)合菌劑BOF8128青枯菌數(shù)量為2.8×106cfu/g，對(duì)番茄根際青枯菌數(shù)量的影響最顯著，比接種時(shí)青枯菌數(shù)量3.0×106cfu/g略低，表明復(fù)合菌劑比單一菌劑在抑制青枯菌數(shù)量增長(zhǎng)方面效果更好。

圖3 不同處理組對(duì)青枯病菌數(shù)量的影響Fig. 3 Effects of different treatments on the number of R. solanacearum

2.3.3 單一及復(fù)合菌劑對(duì)番茄青枯病的防治效果 接種病原菌45 d后，空白對(duì)照（CK1）發(fā)病嚴(yán)重，發(fā)病率達(dá)76.67%，單一及復(fù)合菌劑的處理BOF8128、BOF81和BOF28均能顯著抑制青枯病的發(fā)生，病情指數(shù)分別為11.67、15.83和20.0。復(fù)合菌劑BOF8128對(duì)番茄青枯病的防治效果82.03%，顯著高于單一菌劑處理BOF28防效69.15%（表2）。

表2 不同處理組對(duì)番茄青枯病的防控效果Table 2 The control effect of different treatments on tomato bacterial wilt in greenhouse

3 討論

鏈霉菌對(duì)植物病原菌的抑制作用機(jī)制之一是產(chǎn)生抗生素，其與病原細(xì)菌之間常見有透明的抑菌圈，與病原真菌之間常見有透明的抑菌帶，說(shuō)明它們分泌出抗菌素類物質(zhì)[10]，雖然鏈霉菌對(duì)多種植物的青枯病表現(xiàn)出較好的防效，但大多單一菌株的生防持效性差，防效不理想。將不同作用機(jī)制、不同生長(zhǎng)條件和不同生態(tài)適應(yīng)性等特點(diǎn)的拮抗菌株共同作用，能提高防病效果和穩(wěn)定性[31]。因此，將無(wú)明顯拮抗作用的生防菌株復(fù)合培養(yǎng)，菌株間通過(guò)協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，發(fā)揮出理想的生防效果。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株FX81生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，能降低香蕉根際土壤中病原菌的數(shù)量，對(duì)香蕉枯萎病的防治效果達(dá)81.05%，且能促進(jìn)香蕉植株生長(zhǎng)[26]。菌株FX28有較強(qiáng)的抑制病菌孢子萌發(fā)的能力，對(duì)蜜柚炭疽病菌孢子的萌發(fā)抑制率達(dá)97.0%，對(duì)蜜柚炭疽病的預(yù)防效果和治療效果分別為83.8%和71.1%[27]。本試驗(yàn)將這2株放線菌交叉培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)它們之間無(wú)明顯拮抗作用，進(jìn)一步試驗(yàn)結(jié)果表明2株菌株復(fù)合培養(yǎng)后對(duì)番茄青枯病菌的抑菌圈平均直徑顯著大于單一菌株的抑菌圈平均直徑，與前人研究結(jié)論一致。

葛紅蓮等[32]將5株生防細(xì)菌復(fù)配后澆灌對(duì)盆栽辣椒青枯病的防治效果達(dá)到91.1%，優(yōu)于任何單一菌株，田間采用拌菌堆肥法（添加營(yíng)養(yǎng)載體）和澆灌法的防治效果分別為94.0%和77.0%，增產(chǎn)效果分別為367.0%和57.8%。李勤奮等[33]研究了復(fù)合菌液C1、C2蘸根（未添加營(yíng)養(yǎng)載體）處理對(duì)盆栽番茄的抗病促生作用，結(jié)果表明復(fù)合菌液C1、C2均能明顯促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)，以復(fù)合菌劑C2對(duì)番茄青枯病的防治效果最好，達(dá)66.9%。說(shuō)明生防菌株添加適合的營(yíng)養(yǎng)載體能夠顯著提高防效和促進(jìn)增產(chǎn)，這可能是因?yàn)檫m合的營(yíng)養(yǎng)載體使復(fù)合菌菌量大量增加，更能適應(yīng)復(fù)雜的土壤微生物環(huán)境，提高復(fù)合菌在植株根際的定殖能力，占據(jù)植株根部生態(tài)位點(diǎn)，促進(jìn)其產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的能力，從而達(dá)到有效抑制病害的發(fā)生。且營(yíng)養(yǎng)載體在發(fā)酵過(guò)程中將一些不易利用的營(yíng)養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化為易于植物吸收的小分子物質(zhì)，能為植物提供更豐富的營(yíng)養(yǎng)。譚兆贊等[34]研究結(jié)果表明，復(fù)合微生物菌劑可提高土壤微生物的多樣性，降低土壤病原菌的基數(shù)，從而抑制番茄青枯病的發(fā)生。Lee等[35]比較健康番茄和患青枯病番茄根際土壤微生物多樣性，結(jié)果表明番茄植株根際放線菌豐度高有利于抑制青枯病的發(fā)生，這均與本研究結(jié)果基本一致。Marian等[36]將β-變形菌 TWR114 和非致病性青枯菌TCR112按不同比例復(fù)合后，對(duì)盆栽番茄青枯病的防治效果均優(yōu)于單一菌劑，可顯著降低番茄根際青枯病菌的數(shù)量，其作用機(jī)理研究表明復(fù)合菌具有更強(qiáng)的防御和協(xié)調(diào)抑制作用，有助于提高生防效果。

本文初步研究了2株生防放線菌復(fù)合防治番茄青枯病的效果，充分利用有益菌與病原菌之間的拮抗、競(jìng)爭(zhēng)等關(guān)系，發(fā)揮了生防菌之間的協(xié)同增效特點(diǎn)，降低植株根際病原菌的基數(shù)，從而降低發(fā)病率和病情指數(shù)，促進(jìn)植株生長(zhǎng)。由于本文僅測(cè)定了復(fù)合菌劑的盆栽防效，還未進(jìn)行田間試驗(yàn)，相對(duì)較為復(fù)雜的大田土壤環(huán)境下的應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步研究。