耐輻射芽胞桿菌JK23的鑒定及其生防活性研究

張麗娟，黃 偉，王 寧，宋 博，朱 靜，熱依罕姑麗·阿卜杜克依穆，布堅乃提·阿巴斯，王 瑋*

（1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/ 新疆特殊環(huán)境微生物實驗室, 烏魯木齊 830091；2.農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室/特色林果產(chǎn)業(yè)國家地方聯(lián)合工程研究中心/新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 烏魯木齊 830091）

植物病蟲害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定面臨的最主要的威脅?；瘜W(xué)農(nóng)藥是目前防治病蟲害的主要手段，但是化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用帶來了耕地生態(tài)退化嚴(yán)重、抗藥性增加等諸多危害人畜健康問題，生產(chǎn)中亟需對人類和環(huán)境友好、防效顯著的替代策略，生物防治是目前研究應(yīng)用的熱點。芽胞桿菌因具有超強的生存繁殖能力、豐富的合成代謝產(chǎn)物的能力、易定殖于植物根際且大多對人畜有益的特性，是技術(shù)最成熟、開發(fā)利用最廣泛的生防菌類群，目前應(yīng)用于生物防治的芽胞桿菌主要有解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens、蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、多粘類芽胞桿菌Panebacillus polymyxa和貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis等[1-3]。

芽胞桿菌分泌的抑菌活性物質(zhì)分為兩大類：一類是核糖體途徑合成的蛋白類抗菌物質(zhì)，以酶類、細菌素及其他小分子多肽為主；另一類是非核糖體途徑合成的脂肽類化合物及聚酮類化合物。脂肽類抗生素因其結(jié)構(gòu)多樣、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生抗藥性，是當(dāng)前研究開發(fā)的熱點，主要包括表面活性素（Surfactins）、伊枯草菌素（Iturins）、豐原素（Fengycins）三大環(huán)肽家族及桿菌溶素[4]。表面活性素是目前已知的最有效的生物表面活性劑，能夠作用于生物膜磷脂雙分子層，形成微孔導(dǎo)致細胞內(nèi)容物外泄，致細胞死亡，有很好的溶血、抗病毒、抗支原體和抗細菌作用，對真菌抑制作用不明顯[5]。伊枯草菌素通過改變膜的表面張力，使膜上形成離子通道，導(dǎo)致細胞內(nèi)K+等離子外泄，胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡，影響菌絲生長，具有較強的抑制真菌生長和溶血活性，其中以Iturin A抗真菌活性最好，與常用化學(xué)農(nóng)藥殺菌性能相當(dāng)，是極具開發(fā)潛力的生物源農(nóng)藥[6]。豐原素通過破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，使膜喪失半透性，胞內(nèi)物質(zhì)外泄細胞死亡，對絲狀真菌具有明顯的抑制效果，具有較強的表面活性，溶血作用弱于伊枯草菌素和表面活性素[7]。有報道顯示表面活性素能增強豐原素和伊枯草菌素對真菌的抑制作用。脂肽類物質(zhì)除抗菌活性外，還能促進芽胞桿菌在根部定殖，誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性，顯示出極大的生防潛力[8]。

本研究從新疆某放射性污染土壤中分離得到耐輻射芽胞桿菌JK23，能耐受15 Gryγ-輻照。前期試驗發(fā)現(xiàn)，菌株JK23發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物能夠抑制植物病原真菌孢子萌發(fā)，對野生型秀麗線蟲成蟲具有觸殺作用，但是對病原性細菌抑制作用不明顯。本研究綜合運用形態(tài)學(xué)、生理生化實驗、分子生物學(xué)方法對菌株JK23進行了鑒定，以多種植物病原真菌作為靶向菌對該菌的抑菌譜進行測定，同時對該菌合成脂肽類活性物質(zhì)的能力進行分析，為明確其抑菌活性物質(zhì)組成及抑菌機理提供理論基礎(chǔ)，為生防細菌JK23的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及主要試劑

供試菌株：拮抗細菌JK23由本單位耐輻射微生物資源庫保存；香梨黑斑病菌由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所分離保存；核桃腐爛病菌、馬鈴薯早疫病菌、西瓜枯萎病菌、西瓜蔓枯病菌、水稻惡苗病菌、棉花枯萎病菌由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)贈予（表1）。

表1 試驗所用植物病原菌Table 1 Plant pathogens used for tests

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水定容至1000 mL，自然pH；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（Nutrient agar，NA）：牛肉膏1.0 g，酵母膏2.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，加水定容至1000 mL，pH 7.4；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（Nutrient broth，NB）：牛肉膏1.0 g，酵母膏2.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，加水定容至1000 mL，pH 7.4；R2A固體培養(yǎng)基：酵母浸出粉0.5 g，蛋白胨0.5 g，酪蛋白水解物0.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，磷酸氫二鉀0.3 g，無水硫酸鎂0.024 g，丙酮酸鈉0.3 g，瓊脂15.0 g，pH 7.2；血瓊脂平板（青島日水生物，貨號31402）。

供試試劑：GEN III微孔板（美國 Biolog，貨號 1030）、細菌基因組提取試劑盒（北京鼎國，貨號NEP021-1）、API 20E/50CHB試劑條（法國梅里埃，貨號20100，50300）、液體石蠟（國藥，分析純）、蘇丹III（Sigma）等相關(guān)試劑。

供試儀器：超凈工作臺（浙江孚夏，型號SW-CJ-1F）、氣浴振蕩培養(yǎng)箱（上海天呈，型號TS-2102C）、高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安，型號LDZM-60KGS-Ⅲ）、微生物自動鑒定系統(tǒng)（美國Biolog，型號MiroStation）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（德國布魯克，型號 Autoflex Speed MALDI-TOF-MS）。

1.2 菌株的鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 在超凈工作臺中用無菌接種環(huán)挑取20%甘油管-20 ℃凍存菌液，接種于新鮮的50 mL NB培養(yǎng)基，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，在NA固體平板上劃線培養(yǎng)，28 ℃靜置培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，挑取菌落進行革蘭氏染色。

1.2.2 生理生化特征 菌株的生理生化特性采用API試劑條及Biolog GEN III微孔板測定。用無菌棉簽細菌蘸取NA固體平板上培養(yǎng)24 h的菌落參照API 20E、API 50CHB試劑條使用說明制備菌懸液，接種、培養(yǎng)、檢測并記錄結(jié)果[9]。將細菌純培養(yǎng)物接種于R2A瓊脂平板，30 ℃培養(yǎng)24 h。無菌棉簽蘸取單菌落，棉簽深入含接種液的接種管，上下晃動均勻釋放菌體，制備均一菌懸液。將菌懸液倒入V型加樣槽，用八道移液器按每孔100 μL的量加入Biolog GEN III微孔板。微孔板在33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔12 h，用BIOLOG微生物自動鑒定系統(tǒng)讀板[10]。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 挑取NA固體培養(yǎng)基上的單菌落接種50 mL NB液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，10000 r/min離心1 min收集菌體，用細菌基因組提取試劑盒提取基因組。菌株的16S rRNA基因鑒定選擇通用引物27F和1492R進行擴增測序，引物序列27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。PCR擴增均采用25 μL擴增體系，擴增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃30 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，30 cycles；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標(biāo)條帶經(jīng)切膠回收后委托北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。測序結(jié)果BLAST進行比對，通過MEGA 7.0軟件采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)為1000。

1.3 抑菌活性測定

將凍存的菌株JK23接種于NA平板，28 ℃培養(yǎng)24 h活化后，通過平板對峙法測定其抑菌活性。具體操作如下：用無菌竹簽挑取少量病原真菌菌絲置于 PDA平板中央，拮抗細菌對稱接種于平板四周。同時接種只含有病原真菌的PDA平板作為對照，每組試驗設(shè)計3個重復(fù)。接種平板置于28 ℃培養(yǎng)。待對照菌落長滿平板時，測量抑菌圈直徑。菌絲生長抑制率（%）＝（對照菌落直徑－對峙板菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

1.4 菌株JK23脂肽類化合物相關(guān)基因分析

貝萊斯芽胞桿菌產(chǎn)生脂肽類抗生素是通過非核糖體合成途徑完成，其合成基因是以基因簇的形式分布在基因組中，分別為srfABCD、fenABCDE、ituCBAD。參照鄧建良等[11]的方法，以菌株JK23的基因組DNA為模板，分別用7對引物擴增脂肽類抗生素合成相關(guān)的基因fenB、fenD、ituA、ituD、srfAB、bamC、mycB，采用25 μL PCR體系，擴引物序列見表2，根據(jù)引物退火溫度和擴增片段大小設(shè)計PCR擴增程序[11-14]。引物合成及基因測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行，利用NCBI網(wǎng)站的BLAST功能對所測序列進行同源性分析。

表2 基因擴增用到的引物Table 2 Primers for PCR amplification

1.5 脂肽類化合物鑒定

1.5.1 血平板及排油活性檢測 將經(jīng)NA固體平板活化后的菌株JK23轉(zhuǎn)接于血瓊脂平板，28 ℃下培養(yǎng)48 h觀察菌落周圍有無溶血現(xiàn)象[15]?；罨缶杲臃NNB液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，10000 r/min離心1 min獲得發(fā)酵上清液。取60 mL無菌水加入直徑9 cm培養(yǎng)皿中，于表面加入5 mL液體石蠟（含0.5%蘇丹Ⅲ），形成油膜后加入0.2 mL發(fā)酵液上清，觀察是否形成排油圈[16]。

1.5.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜分析 參照李興玉等[17]方法，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）對脂肽類物質(zhì)進行快速檢測：基質(zhì)工作液為α-氰-4-羥肉桂酸飽和溶液，提取液為70%乙腈（0.1% TFA）。將菌株JK23劃線于NA平板上，挑取1個菌落均勻置于靶板上，依次覆蓋1 μL提取液、1 μL基質(zhì)工作液混勻，自然風(fēng)干，置于儀器離子源進行測定。確定儀器真空度為10-7mbar 或無，開始樣品分析時先進行分子量校正，使用337 nm氮激光源解吸附和電離，質(zhì)量掃描范圍為500～2000 Da。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株JK23的分類鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征 菌株JK23在NA固體平板上30 ℃培養(yǎng)24 h后，形成直徑3～6 mm不規(guī)則圓形菌落，乳白色不透明，干燥，表面褶皺，邊緣鋸齒狀（圖 1A）。菌株染色革蘭氏陽性，菌體形態(tài)呈短桿狀，菌體大?。?.5～0.8）μm×（1.5～2.0）μm，芽胞位于菌體中心或偏中心，大小約為（0.5～0.8）μm×（1.0～1.5）μm（圖1 B）。

圖1 菌株JK23形態(tài)學(xué)特征的菌落圖（A）和菌體圖（B）Fig. 1 Colony diagram and body diagram (B) of the morphological characteristics of strain JK23

表3 菌株JK23及相關(guān)芽胞桿菌的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain JK23 and some related species of the genus Bacillus

利用Biolog GEN III微孔板進行94種表型測試，其中包括71種碳源測試以及23種化學(xué)敏感性測試。將微生物在測試板上顯示出的“表型指紋”同Biolog數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比較，可用于種水平上鑒定。鑒定結(jié)果顯示，JK23與解淀粉芽胞桿菌同源性最近，SIM 值為 0.539。JK23可以利用糊精、D-麥芽糖、D-海藻糖等47種碳源。耐受pH 5.0、8% NaCl，對梭鏈孢酸、D-絲氨酸、醋竹桃霉素、利福霉素SV、二甲胺四環(huán)素、林肯霉素、硫酸四癸鈉、萬古霉素、四唑紫、四唑藍、萘啶酮酸、氨曲南敏感。

API生理生化試驗結(jié)果表明，菌株 JK23氧化酶反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)、明膠液化、β-半乳糖苷酶及V-P反應(yīng)均為陽性，脲酶、吲哚試驗、H2S試驗均為陰性，可以利用糖原、乳糖、棉籽糖。

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，綜合菌株JK23的形態(tài)特征和生理生化特征，初步確定菌株JK23為芽胞桿菌屬菌株。

2.1.2 分子鑒定 經(jīng)測序分析，菌株JK23的16S rDNA序列大小為1424 bp（Genbank序列號MN847602.1），在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），與多株貝萊斯芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌菌株的序列相似性均達到99%以上。選取同源性較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株JK23與貝萊斯芽胞桿菌CR-502位于同一分支（圖2）?；谛螒B(tài)觀察、生理生化檢測和分子鑒定的結(jié)果，將菌株JK23鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。

圖2 基于16S rDNA序列的菌株JK23的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain JK23 based on 16s rDNA sequence cluster analysis

2.2 菌株JK23的抑菌譜測定

通過平板對峙試驗，菌株JK23對下列植物病原菌的抑菌率分別為：香梨黑斑病菌（39.68%）、西瓜枯萎病菌（37.5%）、水稻惡苗病菌（50.0%）、棉花枯萎病菌（53.85%）、番茄早疫病菌（60.7%）、馬鈴薯早疫病菌（73.3%）、西瓜蔓枯病菌（100%），核桃腐爛病菌（100%）。幾乎完全抑制核桃腐爛病、西瓜蔓枯病病原菌的生長（圖3）。重復(fù)試驗及數(shù)次傳代后仍能得到穩(wěn)定的抑菌結(jié)果，可見菌株JK23具有穩(wěn)定、廣譜的抑菌效果。

圖3 菌株JK23對供試植物病原菌的抑制效果（PDA培養(yǎng)基7 d，A：對照組；B：處理組）Fig. 3 Antagonistic effects of strain JK23 against different phytopathogens (PDA medium for 7 d, A: contrast; B: treatment )

與正常生長的菌絲相比，處理組 PDA培養(yǎng)基內(nèi)抑菌圈周圍的菌絲生長緩慢，抑菌圈邊界明顯，顯微鏡下可見：基內(nèi)菌絲頂端膨大、彎曲、畸形，原生質(zhì)凝聚，菌絲生長受到明顯抑制（圖4）。

圖4 菌株JK23對供試植物病原菌的菌絲致畸作用（10×40倍；A：對照組；B：處理組）Fig. 4 Inhibition effects of B. velezensis strain JK23 on mycelial growth of different phytopathogens (magnification times 10×40,A: contrast; B: treatment )

2.3 菌株JK23 脂肽類化合物相關(guān)基因檢測

經(jīng)過PCR擴增，菌株JK23基因組上檢測到參與脂肽類抗生素合成的6個基因ituA（1030 bp）、ituD（615 bp）、bamC（733 bp）、fenD（285 bp）、srfAB（280 bp）、mycB（1166 bp），未檢測到fenB基因（表4）。

表4 PCR產(chǎn)物序列比對結(jié)果Table 4 Alignment results of PCR products

2.4 脂肽類化合物分析

菌株JK23能產(chǎn)生明顯的溶血圈和排油圈（圖5），表明該菌具有較強的生成脂肽的能力。

圖5 菌株JK23的溶血圈和排油圈檢測結(jié)果Fig. 5 Results of hemolysis and oil spreading

芽胞桿菌產(chǎn)生的脂肽類抗生素主要有伊枯草菌素、豐原素和表面活性素，根據(jù)氨基酸及C鏈的長短不同存在多個同系物。伊枯草菌素和表面活性素同系物的分子量分布1000～1100 Da，豐原素同系物的分子量分布在1400～1500 Da。對MALDI-TOF MS檢測得到的分子量比對分析發(fā)現(xiàn)，菌株JK23產(chǎn)物在此分子量區(qū)間主要有8個質(zhì)譜峰，質(zhì)核比（m/z）分別為1044.9、1058.9、1066.8、1074.9、1080.9、1096.8、1102.9、1118.8，峰的分布規(guī)律符合脂肽化合物的質(zhì)譜峰規(guī)律（如1044.9和1058.9分子量相差14 Da，即一個亞甲基（-CH2-），為Iturin的同系物）[22]。根據(jù)文獻報道，1058.9、1080.9、1096.8分別對應(yīng)C15 Iturin的M+H+（分子量1058.4）、M+Na+（分子量1080.4）和M+K+（分子量1096.4），或者對應(yīng)C16 Bacillomycin D的M+H+（分子量1059.4）、M+Na+（分子量1081.4）和M+K+（分子量1097.4）；1044.9、1066.8分別對應(yīng)C14 Iturin的M+H+（分子量1044.4）、M+Na+（分子量1066.4）；1058.9、1074.9可能與已報道的C15 Surfactin的M+Na+（分子量1058.4）和M+K+（分子量1074.4）相對應(yīng)；1102.9、1118.8未在已報道的脂肽化合物中未找到對應(yīng)的分子量，可能是新的脂肽同系物[22]。質(zhì)譜結(jié)果表明，菌株JK23產(chǎn)物中含有多種脂肽產(chǎn)物，可能為C15 Iturin、C14 Iturin、C16 Bacillomycin D、C15 Surfactin及其他[23,24]。

圖6 JK23脂肽化合物的飛行時間質(zhì)譜分析Fig. 6 MS chromatograms of lipopeptides from JK23 by whole cell in situ MALDI-TOF-MS

3 討論

貝萊斯芽胞桿菌作為一種新型的生防芽胞桿菌，廣泛存在于水、土壤等自然環(huán)境中，近年來廣泛報道應(yīng)用于作物的生物防治[25]。李生樟等[26]發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌504能夠特異性拮抗水稻白葉枯病病原菌（黃單胞菌）。Kaki等[27]發(fā)現(xiàn)金盞花內(nèi)生貝萊斯芽胞桿菌對尖孢鐮孢菌和葡萄孢菌有較好抑制作用（＞60%）。貝萊斯芽胞桿菌HN-2對黃單胞菌、芒果炭疽病菌有明顯抑制作用[28,29]。本研究經(jīng)過系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定分析，將耐輻射菌 JK23鑒定為貝萊斯芽胞桿菌，并發(fā)現(xiàn)該菌對多種植物病原菌均有較好的抑制作用，尤其對核桃腐爛病菌、西瓜蔓枯病菌幾乎完全抑制，且具有穩(wěn)定、廣譜的抑菌效果，與前人報道一致。

脂肽類抗生素是目前貝萊斯芽胞桿菌主要開發(fā)的抗菌物質(zhì)之一，主要包括表面活性素、伊枯草菌素、豐原素三大環(huán)肽家族。Chen等[30]比較基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌模式菌株FZB42比枯草芽胞桿菌168具有更豐富的產(chǎn)物合成能力，F(xiàn)ZB42有9個非核糖體多肽合成酶和聚酮化合物合成酶基因簇，包括4個FZB42特有的基因簇（bmyD，pks2，pks3，nrs）。通過MALDI-TOF-MS分析FZB42的脂肽化合物，主要有表面活性素、豐原素、桿菌抗霉素D（伊枯草菌素的一種），而枯草芽胞桿菌B168經(jīng)進一步證實，不產(chǎn)生豐原素和表面活性素，只能合成少量的1種伊枯草菌素[17]。貝萊斯芽胞桿菌YAUB9601，通過產(chǎn)生芽胞桿菌素D、豐原素、地非西汀和桿菌肽等抗生素發(fā)揮抑菌作用[31]。Liu等[32]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌H3的抗真菌物質(zhì)主要是C14-Surfactin和C15-Surfactin。本研究菌株JK23通過PCR擴增，檢測到3類脂肽類抗生素合成和生長素合成相關(guān)的基因，通過脂肽化合物定性檢測和質(zhì)譜分析，進一步明確了菌株JK23產(chǎn)物中可能含有C14 Iturin、C15 Iturin、C16 Bacillomycin D、C15 Surfactin等多種脂肽化合物，包含2種文獻中未見分子量報道的脂肽化合物。與已報道的部分貝萊斯菌株不同，菌株JK23基因組中未檢測到fenB基因，產(chǎn)物中也沒有豐原素同系物。

貝萊斯芽胞桿菌作為新型生防因子，具有強大的合成環(huán)脂肽和聚酮類次級代謝產(chǎn)物的能力，已報道有殺菌、殺線蟲、誘導(dǎo)抗性和促生長作用，可以作為一種實用高效的生防制劑，有效替代化學(xué)農(nóng)藥的使用[24]。本研究中的貝萊斯芽胞桿菌 JK23能夠產(chǎn)生多種脂肽類抗生素，對植物病原真菌均具有明顯的抑制作用，具有高效、廣譜的抑菌活性，生防應(yīng)用前景廣闊。目前菌株JK23的抑菌活性物質(zhì)的作用機理尚不明確，后續(xù)將進行深入研究，為以該菌為基礎(chǔ)的生防制劑的研發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。