黑曲霉快速高效收獲異養(yǎng)小球藻的條件優(yōu)化

鄭瀟,周化嵐,GULTOM Sarman Oktovianus,鄧佳寶,張建國(guó)*

1(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院 食品科學(xué)與工程研究所,上海,200093) 2(Department of Agricultural and Biosystems Engineering,Papua University Manokwari,Papua Barat,Indonesia)

微藻含有豐富的多不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、多糖、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),在食品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,如可作為烘焙食品、飲料、冰淇淋以及嬰兒配方食品等多種食品的原料。此外,微藻還有生物量生產(chǎn)效率高、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、光合作用效率高、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量高等優(yōu)點(diǎn)[1]。但由于微藻細(xì)胞的體積較小(直徑約為1～50 μm),且大規(guī)模培養(yǎng)條件下細(xì)胞濃度較低(0.1～5 g/L),使得微藻的收獲難度較大、成本較高。雖然通過高密度發(fā)酵培養(yǎng)可以提高微藻細(xì)胞密度,但仍存在一些缺陷,如糖耗高、藻細(xì)胞質(zhì)量較低等,因而小球藻高密度發(fā)酵培養(yǎng)還有待進(jìn)一步研究。而一般微藻收獲步驟的成本占總生產(chǎn)成本的20%～30%[2],因此亟需開發(fā)快速高效的微藻收獲技術(shù)。目前,收獲微藻的方法有3類：物理法、化學(xué)法、生物法。離心、過濾、干燥[3-4]等物理法成本高昂、能耗較大；Fe2(SO4)3、Al2(SO4)3、聚乙烯亞胺、聚丙烯酰胺等[5-6]化學(xué)試劑法雖然能收獲微藻但會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染；而生物法成本低、效率高、可生物降解、對(duì)環(huán)境無毒無害,所以生物法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微藻的快速、高效、無污染收獲。目前使用的生物絮凝劑主要是細(xì)菌[7-8]與真菌,但從效果而言,真菌的收獲效果優(yōu)于細(xì)菌,因?yàn)檎婢慕Y(jié)構(gòu)比細(xì)菌更穩(wěn)定,真菌的菌絲可以形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[9],使微藻細(xì)胞與真菌形成一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合體,增強(qiáng)收獲結(jié)構(gòu),促進(jìn)微藻細(xì)胞的收集,從而收獲更多的微藻生物量。

常用于收獲微藻的絲狀真菌有黑曲霉、米曲霉、煙曲霉、青霉、木霉、毛霉等[10-12]。其中應(yīng)用最廣泛的絲狀真菌為黑曲霉。因?yàn)楹谇共粌H可以快速成球完成對(duì)微藻的收獲,還可以提高收獲的微藻細(xì)胞質(zhì)量,此外黑曲霉具有生長(zhǎng)活力高、成本低、絮凝效果好且菌絲結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定、易于形成顆粒等優(yōu)點(diǎn)[13-14],所以使用黑曲霉收獲微藻是一種綠色、高效、快速、可持續(xù)的收獲方法。本研究使用生物安全性好的黑曲霉(AspergillusnigerATCC 1015)對(duì)普通小球藻(ChlorellavulgarisFACHB-8)進(jìn)行收獲。黑曲霉ATCC 1015是食品安全性好的工業(yè)微生物菌株,目前已經(jīng)用于檸檬酸、葡萄糖酸等食品組分的生產(chǎn),所以使用黑曲霉ATCC 1015可為微藻在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。此外,通過黑曲霉ATCC 1015可生產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、果膠酶、檸檬酸合成酶等多種酶[15-17],在淀粉加工、發(fā)酵、釀造、飲料生產(chǎn)等領(lǐng)域發(fā)揮了巨大的作用[18-19]。因此,使用該菌株收獲小球藻是一種安全、無污染、可持續(xù)的收獲方法。最后,本研究考察了不同共培養(yǎng)條件對(duì)黑曲霉ATCC 1015收獲普通小球藻的影響并培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,為快速高效收集微藻細(xì)胞提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

黑曲霉(AspergillusnigerATCC 1015),美國(guó)典型微生物保藏中心；普通小球藻(ChlorellavulgarisFACHB-8),為綠藻門小球藻屬單細(xì)胞綠藻,中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)?；瘜W(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,國(guó)藥化學(xué)試劑上海公司。

722S紫外分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司；CX40光學(xué)顯微鏡,奧林巴斯公司；TQZ-312全溫振蕩器,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 培養(yǎng)基與溶液

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基(g/L)：稱取3.7 g PDA固體溶于100.0 mL去離子水,121 ℃、15 min滅菌后備用。

改良BG-11培養(yǎng)基配方(g/L)：葡萄糖2.0、K2HPO4·3H2O 0.04、MgSO4·7H2O 0.075、CaCl2·2H2O 0.036、檸檬酸0.006、檸檬酸鐵銨0.006、EDTA 0.001、NaNO31.5、Na2CO30.02、微量元素混合液(1.0 mL),115 ℃、20 min滅菌后備用。

微量元素混合物(g/L)：H3BO32.86、MnCl2·4H2O 1.81、ZnSO4·7H2O 0.222、Na2MoO4·2H2O 0.39、CuSO4·5H2O 0.079、CoCl2·6H2O 0.05,用1 mol/L鹽酸調(diào)pH至 7.1。

CCM培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10.0、NH4Cl 2.0、KH2PO42.0、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.02,115 ℃、20 min滅菌后備用。

葡萄糖溶液(g/L)：稱取20.0 g葡萄糖溶于100.0 mL去離子水,115 ℃、20 min滅菌后備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 孢子懸液的制備

將黑曲霉從保藏管中接種至PDA平板上,28 ℃培養(yǎng)7 d,將10 mL無菌水倒入黑曲霉的PDA平板上,輕輕振搖后使用涂布棒進(jìn)行刮取,然后倒入滅菌的錐形瓶中。重復(fù)3次即得到高濃度的孢子懸液,在錐形瓶中加10～20 mL無菌水稀釋并振蕩使孢子均勻分布,用紫外分光光度計(jì)在620 nm處測(cè)定其吸光度。

1.3.2 普通小球藻培養(yǎng)與菌藻共培養(yǎng)

普通小球藻培養(yǎng)：將普通小球藻液在裝有100 mL改良BG-11培養(yǎng)基的三角瓶(250 mL)內(nèi),100 r/min,25 ℃,培養(yǎng)7～14 d。如需轉(zhuǎn)接,按1∶5(藻液∶培養(yǎng)基)的比例進(jìn)行再次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。

菌藻共培養(yǎng)：取20 mL新鮮藻液于50 mL離心管中離心,8 000 r/min,5 min,棄上清液,將離心后的藻細(xì)胞加入培養(yǎng)基中,在680 nm處測(cè)定吸光度,再取稀釋好的孢子懸浮液(1.26 OD620)加入培養(yǎng)基中,如圖1所示,設(shè)置溫度為28 ℃,0～24 h,轉(zhuǎn)速為130 r/min,24～48 h,轉(zhuǎn)速為150 r/min,共培養(yǎng)24 h后再添加200 g/L葡萄糖營(yíng)養(yǎng)液5 mL至培養(yǎng)基內(nèi),48 h后在680 nm處測(cè)定溶液的吸光度,并按公式(1)計(jì)算收獲率。

(1)

圖1 黑曲霉孢子收獲微藻的過程Fig.1 Harvesting process of microalgae by A.niger spores

1.3.3 生長(zhǎng)曲線與收獲時(shí)間的確定

按1.3.2的共培養(yǎng)方法進(jìn)行共培養(yǎng),間隔4 h取樣測(cè)定溶液的吸光度并在顯微鏡下觀察菌絲球與菌藻體的形態(tài)。

1.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

按1.3.2的共培養(yǎng)方法對(duì)轉(zhuǎn)速、pH(2、3、4、5、6)、葡萄糖添加量(10、15、20、25 g/L)、FeSO4添加量(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L)、MgSO4添加量(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L)、CaCl2添加量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L)、初始孢子濃度(100、200、300、400、500 個(gè)/μL)、初始微藻濃度(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 OD680)等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),利用Microsoft Visio 2016繪制流程圖,Origin 9.1軟件繪制所有數(shù)據(jù)圖,利用IBM SPSS Statistics 25軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,并采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)間的微藻生長(zhǎng)情況與收獲率

當(dāng)黑曲霉與微藻共培養(yǎng)時(shí),微藻能夠利用葡萄糖進(jìn)行高密度發(fā)酵生長(zhǎng),所以微藻的生物量增加。如圖2-a所示,在0～4 h內(nèi),微藻液濃度由0.48 OD680下降至0.36 OD680,說明該時(shí)間內(nèi)微藻濃度降低。這是由于小球藻生長(zhǎng)緩慢,菌絲球吸附速率大于小球藻生長(zhǎng)速率。而4～24 h,微藻濃度由0.36 OD680上升至0.52 OD680,微藻濃度達(dá)到最大值,說明該時(shí)間段內(nèi)小球藻生長(zhǎng)較快,菌絲球吸附速率小于小球藻生長(zhǎng)速率,小球藻增長(zhǎng)量大于菌絲球吸附量。而在24～36 h,雖然微藻濃度持續(xù)下降,但其收獲率卻持續(xù)升高,如圖2-b所示,收獲率升高至36.51%,其原因可能是此階段黑曲霉孢子已逐漸萌發(fā)生長(zhǎng)出菌絲形成菌絲球,大量的菌絲將小球藻吸附于表面,并通過剪切力將吸附了小球藻的菌絲纏繞形成菌藻顆粒體,收獲更多的藻細(xì)胞,提高收獲率。所以小球藻生長(zhǎng)量小于菌絲吸附量時(shí),小球藻的收獲率不斷升高,在48 h達(dá)到最大值,為70.54%。

a-微藻吸光度;b-收獲率圖2 共培養(yǎng)過程中微藻生長(zhǎng)情況與收獲率Fig.2 Growth and harvesting ratio of microalgae during co-culture process

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間的黑曲霉形態(tài)

黑曲霉孢子是凝聚型[20-21]孢子,所謂凝聚型孢子是指多個(gè)孢子首先聚集、膨脹,再生長(zhǎng)出菌絲,最后菌絲聚集纏繞形成菌絲球的孢子。如圖3所示,孢子在0～8 h內(nèi)首先通過相互碰撞聚集在一起形成孢子聚集體,孢子聚集體在8～16 h內(nèi)萌發(fā),萌發(fā)形成的菌絲利用更多的表面積吸附?jīng)]有萌發(fā)的孢子,在16～32 h 內(nèi)快速生成完整的菌絲,最后在32～48 h形成完整的菌絲球。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間的黑曲霉形態(tài)Fig.3 Morphology of A.niger at different times

并且由圖3黑曲霉孢子的成球時(shí)間可知,48 h即可成球,當(dāng)使用黑曲霉孢子與小球藻共培養(yǎng)時(shí),48 h即可成球收獲微藻,因此使用黑曲霉收獲小球藻的時(shí)間可以設(shè)置為48 h。

2.3 轉(zhuǎn)速優(yōu)化

黑曲霉是好氧菌,在成球過程中需要一定的氧氣。轉(zhuǎn)速大小對(duì)于溶液中氧氣含量有顯著影響,因此轉(zhuǎn)速對(duì)于黑曲霉孢子生成菌絲球收獲微藻具有顯著影響。如圖4所示,當(dāng)48 h連續(xù)130 r/min時(shí),因轉(zhuǎn)速較低,溶液中溶氧量少以及溶氧的不均勻使得菌絲生長(zhǎng)較慢。并且在較低轉(zhuǎn)速下菌絲體所受剪切力較小,無法產(chǎn)生高剪切力使萌發(fā)的孢子去除周圍多余的菌毛分散形成單獨(dú)的菌絲球,相互之間纏繞得不緊密,使得菌絲球結(jié)構(gòu)松散、球徑大,所以對(duì)微藻的收獲率較低,為33.74%。而當(dāng)使用連續(xù)48 h較高轉(zhuǎn)速150 r/min時(shí),在培養(yǎng)初期,高轉(zhuǎn)速不利于孢子聚集萌發(fā)形成菌絲球,會(huì)使孢子分散在培養(yǎng)基中形成直徑較小的菌絲球,收獲微藻的效率最低,僅為17.66%。因此,連續(xù)48 h的130 r/min與150 r/min并不能實(shí)現(xiàn)黑曲霉對(duì)微藻的高效率收獲,所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)共培養(yǎng)過程使用混合轉(zhuǎn)速130 r/min(0～24 h)與150 r/min(24～48 h)進(jìn)行培養(yǎng)。因?yàn)槌跏嫉牡娃D(zhuǎn)速有利于孢子聚集萌發(fā)生成菌絲形成菌絲球,隨后高轉(zhuǎn)速產(chǎn)生高剪切力與較高的溶氧量使萌發(fā)的孢子去除周圍多余的菌毛分散形成單獨(dú)的菌絲球,從而提高微藻的收獲率,收獲率最高可達(dá)76.58%(P<0.05),所以混合轉(zhuǎn)速130 r/min(0～24 h)與150 r/min(24～48 h)最適合黑曲霉孢子對(duì)微藻的收獲。

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)收獲率的影響Fig.4 Effect of rotating speed on harvesting ratio注:不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 初始pH優(yōu)化

pH是影響孢子凝聚萌發(fā)成菌絲球的重要因素,因?yàn)殒咦泳哂衟H依賴性,所以當(dāng)改變培養(yǎng)基pH時(shí)對(duì)于黑曲霉收獲微藻具有顯著的影響。如圖5所示,當(dāng)初始pH為2時(shí),由于培養(yǎng)基的酸性較強(qiáng),會(huì)抑制微藻的生長(zhǎng),不利于黑曲霉孢子與微藻的生長(zhǎng),所以難以形成菌絲球,只有明顯的菌絲生成,收獲率較低,為27.30%。而隨著初始pH的升高,pH為3、4、5時(shí)均可形成菌絲球,pH為3時(shí)形成的菌絲球質(zhì)量最好、生物量最大,收獲微藻的生物量也最多,收獲率最高為47.51%。而當(dāng)pH為4、5時(shí),收獲率分別為39.07%和11.98%,生成的菌絲球小,不均勻,韌性差,因此其收獲效率較低。隨著初始pH的持續(xù)升高,當(dāng)pH為6時(shí),收獲率則降為0,原因可能是此時(shí)pH僅有利于微藻的生物量增長(zhǎng),不利于黑曲霉孢子的生長(zhǎng),因此收獲率最低。未調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH(對(duì)照組pH為4.5)的微藻收獲率可達(dá)77.72%,與實(shí)驗(yàn)組相比有顯著差異(P<0.05),表明此時(shí)的pH環(huán)境最適合黑曲霉孢子與微藻的生長(zhǎng),且此時(shí)形成的菌絲球質(zhì)量高、均勻性好,生物量最大,收獲微藻的生物量也更多,因此未調(diào)節(jié)pH的初始培養(yǎng)基(對(duì)照組pH為4.5)最適合黑曲霉孢子和微藻的共培養(yǎng)。

圖5 初始pH對(duì)收獲率的影響Fig.5 Effects of initial pH value on harvesting ratio

2.5 葡萄糖添加量?jī)?yōu)化

黑曲霉可以利用甘露醇、葡萄糖、木聚糖和蔗糖等多種碳源進(jìn)行生長(zhǎng),但葡萄糖最易作為碳源。黑曲霉孢子在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h即可快速形成菌絲球。如圖6-a所示,隨著葡萄糖質(zhì)量濃度不斷升高,收獲率先升高后降低,在20 g/L時(shí)收獲效率最高,為38.24%,這是由于葡萄糖質(zhì)量濃度的升高能夠顯著促進(jìn)微藻的生長(zhǎng),微藻的生物量顯著增加(P<0.05),此時(shí)孢子無足夠的碳源促進(jìn)其菌絲球直徑的增長(zhǎng),因此生成的菌絲球直徑小、數(shù)量多、韌性差,收獲率較低；而當(dāng)采用分批補(bǔ)充葡萄糖(10+10)的策略時(shí),分批添加的收獲率顯著高于單次添加(P<0.05),可達(dá)到83.19%。這是由于采用分批添加策略時(shí),初始的低葡萄糖濃度有利于微藻的生長(zhǎng)、孢子的萌發(fā)和菌絲的生成,不會(huì)產(chǎn)生高葡萄糖濃度促進(jìn)微藻生長(zhǎng)而不利于黑曲霉孢子生長(zhǎng)的現(xiàn)象,此時(shí)孢子已經(jīng)逐漸聚集萌發(fā)形成菌絲球,而后期添加的葡萄糖量有助于菌絲球直徑的增長(zhǎng)以及菌絲的形成,可以顯著提高收獲率。所以采用分批添加葡萄糖的策略最適合黑曲霉與微藻的共培養(yǎng)。而如圖6-b所示,24～48 h收獲率隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加而不斷提高,添加8 g/L即可獲得82.31%的收獲率,與添加10 g/L的收獲率83.04%無顯著差異(P<0.05),所以24～48 h補(bǔ)充8 g/L的葡萄糖即可。

a-初始葡萄糖濃度對(duì)收獲率的影響;b-24 h后添加的葡萄糖濃度對(duì)收獲率的影響圖6 不同葡萄糖添加方式對(duì)收獲率的影響Fig.6 Effects of different glucose addition strategies on harvesting ratios

綜上,采用分批添加葡萄糖的策略最適合黑曲霉與微藻的共培養(yǎng),選擇0～24 h的10 g/L的葡萄糖質(zhì)量濃度和24～48 h再添加8 g/L的葡萄糖的碳源條件最適合黑曲霉孢子對(duì)微藻的收獲。

2.6 FeSO4、MgSO4、CaCl2添加量的優(yōu)化

不同的金屬離子種類與濃度對(duì)黑曲霉收獲微藻過程有不同的影響。如圖7-a所示,當(dāng)FeSO4質(zhì)量濃度為0.02 g/L時(shí),微藻的收獲率最高,為66.70%。而隨著FeSO4質(zhì)量濃度的不斷升高,小球藻的收獲率不斷降低(P<0.05),質(zhì)量濃度為0.1 g/L時(shí),收獲率最低,為37.98%。這是因?yàn)镕e2+與菌絲球的大小相關(guān),當(dāng)培養(yǎng)基中的Fe2+濃度增加,孢子形成的菌絲球數(shù)量將減少且生成的菌絲球大小極不均勻。因此菌絲球捕獲的藻細(xì)胞數(shù)目減少,收獲率降低顯著(P<0.05),所以FeSO4的最適添加量為0.02 g/L。如圖7-b所示,當(dāng)MgSO4質(zhì)量濃度為0.2 g/L時(shí),收獲率最低為68.62%。隨著MgSO4質(zhì)量濃度的不斷升高,收獲率顯著提高(P<0.05),當(dāng)MgSO4質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí),收獲率最高為80.45%。這是因?yàn)镸g2+能夠促進(jìn)菌絲球數(shù)量增多,且生成的菌絲球大小均勻、表面光滑、分散性好,并且Mg2+在培養(yǎng)初期的孢子聚合過程中能夠起到促進(jìn)生長(zhǎng)作用,可加快菌絲球的形成,縮短菌絲球的形成時(shí)間與小球藻的收獲時(shí)間。雖然Mg2+可以促進(jìn)菌絲球數(shù)目的增長(zhǎng),提高微藻的收獲率,但是隨著濃度的增加,菌絲球的體積逐漸減小,因此高濃度的Mg2+濃度不利于菌絲球體積的增長(zhǎng),但較低的濃度也不利于收獲。因此最適合菌絲球收獲小球藻的MgSO4質(zhì)量濃度為0.5 g/L。如圖7-c所示,隨著Ca2+濃度的增加,收獲率先升高后降低。當(dāng)CaCl2添加量為0.3 g/L,收獲率最高,為77.08%。而不添加Ca2+(對(duì)照組)的收獲率為85.02%,顯著高于添加Ca2+的實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),其原因?yàn)榕囵B(yǎng)基的pH較低,當(dāng)向培養(yǎng)基中加入Ca2+會(huì)導(dǎo)致真菌和微藻的Zeta電位產(chǎn)生較大差異。

a-FeSO4;b-MgSO4;c-CaCl2圖7 FeSO4、MgSO4、CaCl2添加量對(duì)收獲率的影響Fig.7 Effects of FeSO4,MgSO4,CaCl2 supplemental amount on harvesting ratio

因此Ca2+并不能促進(jìn)菌絲球?qū)π∏蛟宓男跄?因此無需向培養(yǎng)基中添加Ca2+以促進(jìn)黑曲霉菌絲球收獲小球藻。

2.7 初始孢子濃度優(yōu)化

當(dāng)向培養(yǎng)基中接種黑曲霉孢子時(shí),孢子濃度對(duì)微藻的收獲率有顯著影響,當(dāng)接種量較小時(shí),生成的菌絲球不足以收獲所有的微藻細(xì)胞,因此收獲率較低。如圖8所示,如接種量為1×107個(gè)/mL時(shí),收獲率僅為38.70%,而隨著孢子接種量的不斷增加,收獲率不斷提高(P<0.05)。這是因?yàn)殡S著孢子濃度的升高,生成的菌絲球數(shù)不斷增多,收獲的藻細(xì)胞數(shù)不斷增加,收獲率逐漸升高。當(dāng)孢子濃度為5×107個(gè)/mL,收獲率可達(dá)73.56%。所以適當(dāng)增加孢子的數(shù)目可以提高收獲率,有利于菌-藻體的形成。當(dāng)加入的孢子數(shù)過量時(shí),孢子與藻細(xì)胞共同競(jìng)爭(zhēng)碳源,孢子會(huì)消耗大部分碳源,小球藻將無法獲得足夠的碳源支持其生長(zhǎng),因此最適初始孢子濃度為5×107個(gè)/mL,菌藻數(shù)量比為1∶70(表1)。

表1 不同孢子體積的菌藻數(shù)量比Table 1 Fungal spores-algal ratios of different fungal volumes

圖8 菌藻比對(duì)收獲率的影響Fig.8 Effects of fungal spores-algal ratios on harvesting ratio

2.8 初始微藻濃度優(yōu)化

初始微藻濃度對(duì)微藻的收獲率具有顯著影響。如圖9所示。當(dāng)初始微藻濃度為0.20 OD680時(shí),收獲率僅為43.09%。隨著微藻濃度的不斷升高,收獲率顯著提高(P<0.05),當(dāng)濃度為0.80 OD680時(shí),收獲率最高,為88.79%。

圖9 初始藻液吸光度對(duì)收獲率的影響Fig.9 Effect of initial absorbances of algal cultivation on harvesting ratio

這是因?yàn)殡S著微藻濃度的增加,菌絲球收獲的藻細(xì)胞數(shù)不斷增多,收獲率逐漸升高。這表明增加藻細(xì)胞數(shù)有利于菌-藻體的形成,提高收獲率。但是當(dāng)藻細(xì)胞的濃度過高時(shí),需要更多的碳源,剩下的碳源無法支持孢子形成菌絲球?qū)е率斋@率不再升高,所以本研究中最適的初始藻液濃度為0.80 OD680,藻細(xì)胞濃度為3.4×106個(gè)/mL。

3 結(jié)論與討論

由于不同應(yīng)用條件下黑曲霉收獲微藻的影響因素較多,如pH、溫度、搖速、培養(yǎng)時(shí)間、金屬離子種類與濃度、碳源種類與濃度、菌藻比、初始真菌孢子濃度、初始微藻細(xì)胞濃度、光照種類與光源波長(zhǎng)等因素。因此為了實(shí)現(xiàn)黑曲霉對(duì)微藻快速高效收獲可以對(duì)共培養(yǎng)的多個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化。如GULTOM等[22]通過共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)成球時(shí)間為3、5、7 d,但本研究中黑曲霉2 d即可成球并對(duì)微藻進(jìn)行收獲,可以大幅度縮短收獲微藻的時(shí)間,實(shí)現(xiàn)對(duì)微藻的快速收獲。而畢生雷等[23]通過對(duì)霉菌收集異養(yǎng)小球藻的培養(yǎng)條件進(jìn)行的優(yōu)化雖然可以有效收集部分藻細(xì)胞,但并不能實(shí)現(xiàn)高效率的收獲。因此本研究在其基礎(chǔ)上對(duì)混合轉(zhuǎn)速進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明,混合轉(zhuǎn)速的收獲效果優(yōu)于單一轉(zhuǎn)速,通過混合轉(zhuǎn)速可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微藻的高效收獲。此外,不同的金屬離子[24]對(duì)黑曲霉的成球以及收獲微藻有不同的影響,如Fe2+可致菌絲球數(shù)量較少且大小極不均勻。Mg2+不僅能促進(jìn)菌絲球數(shù)量增多,且生成的菌絲球大小均勻、表面光滑。Ca2+可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)通路[25]影響疏水性和細(xì)胞壁完整性從而影響黑曲霉生物膜的形成。因此通過對(duì)金屬離子濃度進(jìn)行優(yōu)化可以最大限度的減少金屬離子的添加,減少污染與降低成本。由結(jié)果可知,較高的葡萄糖濃度會(huì)促進(jìn)小球藻的快速增長(zhǎng),促進(jìn)黑曲霉孢子與小球藻對(duì)碳源形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,不利于黑曲霉孢子的成球以及微藻的收獲。所以通過葡萄糖濃度的優(yōu)化可以減少葡萄糖添加量、降低成本、提高收獲率,分批添加的收獲率顯著高于一次添加,因?yàn)椴捎梅峙a(bǔ)充葡萄糖的策略,可以很好地緩解黑曲霉孢子與小球藻對(duì)葡萄糖的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,最大限度提高微藻收獲率,實(shí)現(xiàn)對(duì)微藻的高效收獲。此外,通過對(duì)初始孢子及微藻濃度的優(yōu)化可以使收獲率最高達(dá)88.79%,因此通過對(duì)菌藻共培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化能夠快速、高效地收集大部分藻細(xì)胞。

但由于本研究微藻的收獲率沒有達(dá)到100%,因此還需對(duì)黑曲霉與小球藻共成球的機(jī)制進(jìn)一步分析以提高黑曲霉對(duì)小球藻的收獲率,達(dá)到快速高效收獲小球藻的目的。目前關(guān)于黑曲霉與小球藻之間的作用力主要分為靜電相互作用、疏水相互作用、鹽橋作用3類,因此未來可以分析靜電相互作用、疏水相互作用[21]、鹽橋作用[26-27]在黑曲霉和微藻共培養(yǎng)過程中是否存在及其變化規(guī)律,建立培養(yǎng)條件與作用力的關(guān)系,并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化,建立低成本、高效率、可持續(xù)收獲的微藻收獲體系。此外,因?yàn)楹谇笰TCC 1015是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株,目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于淀粉加工、飲料、檸檬酸等食品物質(zhì)的生產(chǎn)。而普通小球藻具有高蛋白、低脂肪、低糖、低熱量以及維生素、礦物質(zhì)元素含量豐富的優(yōu)點(diǎn)[28],并且小球藻中含有高含量的EPA和DHA以及亞麻酸等必需脂肪酸,它不僅具有促生長(zhǎng)作用,而且還可增強(qiáng)機(jī)體免疫力。因此本實(shí)驗(yàn)中的黑曲霉與小球藻的混合物在飲料、奶粉、保健品、食品酶等食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。兩者的混合物不僅可以提高蛋白質(zhì)、必需脂肪酸、維生素和微量元素等的含量,還可以極大程度地豐富食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,使?fàn)I養(yǎng)更趨于平衡,但關(guān)于黑曲霉與小球藻混合物的回收以及如何在食品領(lǐng)域的安全應(yīng)用還需進(jìn)一步研究分析。