首烏藤治療阿爾茨海默病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

譚鋮，羅洪斌,2*，黃勝

(1 湖北民族大學(xué) 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室 & 醫(yī)學(xué)部，恩施 445000；2 湖北民族大學(xué) 神經(jīng)精神共患病研究所，恩施 445000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一種發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)退行性疾病.隨著社會老齡化進程的加快，AD發(fā)病率和發(fā)病人數(shù)急劇上升，目前我國65歲以上的老年人發(fā)病率大約在4.8%[1]，且AD的發(fā)病率隨著年齡的增長而升高，已成為嚴(yán)重威脅老齡人群身心健康的常見疾病.由于記憶力及智力衰退，AD患者生活不能自理，晚期幾乎完全需要他人護理，給社會和家庭帶來了沉重負(fù)擔(dān)和極大痛苦[1].

目前，臨床上治療阿爾茨海默病的藥物主要有乙酰膽堿酯酶抑制劑，谷氨酸受體抑制劑等.這些藥物可緩解認(rèn)知功能下降所引發(fā)的癥狀，但無法從根本上消除病因[2].因此，尋找更為有效的AD治療藥物就顯得格外重要.

中醫(yī)學(xué)是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)寶庫，在防治疾病方面具有不可替代的優(yōu)勢，很多中藥的潛在治療作用正在挖掘并得到有效應(yīng)用.中醫(yī)學(xué)中AD被稱為“癡呆”，又名呆病.其病位在腦，與心肝脾腎關(guān)系密切，基本病機為髓海空虛，元神失養(yǎng)[3].臨床分期常依據(jù)癥狀分為平臺期、波動期、下滑期.中醫(yī)治療老年癡呆的論治主要體現(xiàn)于補腎健脾、養(yǎng)心安神[4].近年來，許多基于中醫(yī)理論研制出來的中藥單體或復(fù)方制劑常通過多組分作用和多靶點方式來治療AD等疾病，取得了良好的治療效果，如傳統(tǒng)中藥千層塔有效成分石杉堿甲就已廣泛應(yīng)用于AD等神經(jīng)退行性疾病的早期治療[4]，這與中醫(yī)理論強調(diào)整體觀來治療疾病與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論高度契合.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)、多元藥理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科知識[5]并通過分析藥物的有效成分，映射疾病相關(guān)靶點，利用多靶點、多通路與疾病的相互作用形成可視化網(wǎng)絡(luò)，在探索治療途徑，明確藥物療效特別是尋找藥物有效成分方面具有非常重要的作用，與中醫(yī)理論所強調(diào)的整體觀高度吻合.近年來，國內(nèi)眾多學(xué)者利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究了許多中藥材的有效成分及治療疾病的靶點、機制，為許多疾病的藥物開發(fā)提供了新的思路.黃斌等[6]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了藥物頭頂一顆珠治療阿爾茨海默病的可行性，驗證了頭頂一顆珠可通過抑制乙酰膽堿酯酶活性、促進神經(jīng)元及突觸發(fā)育等機制改善AD的發(fā)展.時悅等[7]研究預(yù)測了開心散緩解AD可能與抑制乙酰膽堿酯酶活性、抑制Tau的過度磷酸化等相關(guān).說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在探討中藥治療AD的有效成分及其作用分子機制方面具有非常重要的預(yù)測作用.

首烏藤(PolygnimultifloriCaulis)，又名夜交藤，為蓼科植物何首烏(PolygonummultiflorumThunb.)的藤莖，性平，味甘.具有養(yǎng)血安神、祛風(fēng)通絡(luò)之功效，屬養(yǎng)心安神藥.臨床上常用于治療失眠夢多、血虛身痛等[8].針對處于波動期的癡呆患者，中醫(yī)常使用含首烏藤的天麻鉤藤飲進行治療，其治法治則主要為清心平肝、安神定志，從而緩解健忘顛倒及認(rèn)知損害[9].劉瓊麗等發(fā)現(xiàn)首烏藤能通過調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶等緩解小鼠腦的氧化應(yīng)激損傷[10]，而氧化應(yīng)激又是AD可能的發(fā)病機制之一.因此，首烏藤具有治療AD的潛在作用，有必要借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)研究方法深入研究探討該藥物治療AD的有效成分及其作用分子機制.

鑒于此，本文擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)知識，篩選首烏藤有效成分，確定其映射AD疾病的靶點及相關(guān)細(xì)胞信號通路，探究其有效成分及其治療AD的作用機制，為后續(xù)研究提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 首烏藤有效成分篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID)(http://www.megabionet.org/tcmid/)檢索首烏藤的化合物成分，并根據(jù)相關(guān)文獻報道對其有效成分進行補充.按照生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%對所獲得的化合物進行初步篩選.在Pub Chem數(shù)據(jù)庫對首烏藤的有效成分進行檢索，獲得每個成分的Canonical SMILES格式，將SMILES號依次導(dǎo)入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫中，對所分析的化合物進行準(zhǔn)確的生物活性分子靶點預(yù)測，在物種選擇為人類的基礎(chǔ)上將結(jié)果導(dǎo)出.

1.2 AD疾病靶點的獲取

以“Alzheimer′s disease”為關(guān)鍵詞在TTD數(shù)據(jù)庫(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(https://www. genecards. org)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org)對其(即AD)進行檢索，對檢索到AD的已知潛在靶點進行匯總，同時刪除重復(fù)靶點.在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索所得到的靶點按照大于Score值進行篩選，而Score大小與靶點的密切程度成正相關(guān).再將最終所得靶點基因在Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)中進行基因的標(biāo)準(zhǔn)化.

1.3 首烏藤-AD疾病靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將檢索并篩選到的首烏藤有效成分進行簡稱命名，分別由SWT1-SWTn表示.將首烏藤成分潛在作用靶點信息與AD的疾病相關(guān)靶點信息均導(dǎo)入EXCEL中，保留其共有靶點，去除其他靶點.整理后導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中進行首烏藤-AD疾病靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，并對該網(wǎng)絡(luò)進行分析.將每個節(jié)點的顏色按照自由度進行漸變，顏色的深淺與該節(jié)點的重要程度呈正相關(guān).

1.4 首烏藤成分-AD靶點與通路的富集分析

DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)是一個基因功能在線注釋平臺，它能對所分析的基因進行系統(tǒng)提取，展現(xiàn)其所涉及的疾病、蛋白、通路以及進行GO、KEGG的功能注釋與富集分析，能幫助研究者從分子層面更加深入地了解基因之間的富集關(guān)系[11].將首烏藤作用于AD的潛在靶點導(dǎo)入到DAVID平臺，對其進行GO與KEGG的分析，對導(dǎo)出的結(jié)果進行表格整理與圖形可視化，以便后續(xù)分析討論.

1.5 首烏藤成分-AD靶點-重要信號通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運用Cytoscape3.7.2構(gòu)建首烏藤成分-AD靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)，進一步分析其活性成分、作用靶點及信號通路之間的相互作用關(guān)系.

2 結(jié)果與分析

2.1 首烏藤有效成分及靶點的篩選結(jié)果

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫、TCMID數(shù)據(jù)庫以及文獻[12-13]報道初步提取出首烏藤有效成分53種，經(jīng)OB限定篩選后得到活性成分14種，分別以SWT1-SWT14表示(見表1)，其中BBB(blood brain barrier)值用于衡量分子對血腦屏障的通透性，BBB<-0.3的化合物通透性差，BBB介于-0.3～0.3則具有中等通透性，BBB>0.3則具有強穿透性[14].將14種化合物在Swiss Target Prediction中進行靶點預(yù)測后得到成分作用靶點383個.

表1 首烏藤潛在活性化合物基本信息Tab.1 Basic information of potential active compounds of Polygni multiflori Caulis

2.2 AD相關(guān)靶點的獲取

利用TTD、Drugbank、Genecards及OMIM數(shù)據(jù)庫對AD進行檢索，對于Genecards數(shù)據(jù)庫按照score值大小選擇相關(guān)性較高的靶點，刪去重復(fù)靶點最終得到靶點228個.

2.3 首烏藤成分-AD疾病靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將首烏藤有效成分潛在作用靶點與AD疾病相關(guān)的靶點導(dǎo)入Excel進行比較，保留其中共有的靶點并繪制韋恩圖，得到首烏藤成分-AD共同靶點50個(見圖1).

圖1 首烏藤成分-AD靶點韋恩圖Fig.1 Venn map of Polygni multiflori Caulis component and AD target

而首烏藤成分-AD共有的50個靶點具體信息見表2.進而將首烏藤成分-AD靶點對應(yīng)信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，繪制首烏藤成分-AD靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2.

圖2 首烏藤成分-AD疾病靶點圖Fig.2 Disease target map of Polygni multiflori Caulis compatibility ingredients-AD 注：邊形代表首烏藤；菱形代表首烏藤有效成分；圓形代表首烏藤與AD共同作用的靶點；節(jié)點顏色隨自由度漸變，顏色越深則其在網(wǎng)絡(luò)中越重要

表2 首烏藤映射AD疾病的共同靶點的相關(guān)名稱Tab.2 Related names of Polygni multiflori Caulis mapping the common target of AD

表2(續(xù))

2.4 GO過程富集分析

DAVID平臺進行GO功能富集分析后共得到GO條目185個，其中生物過程(biological process, BP)條目117個，細(xì)胞組分(cellular component, CC)條目32個，分子功能(molecular function, MF)條目36個.按照分析數(shù)據(jù)中錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.01進行限定，得到的BP、CC、MF組分如表3所示.而GO功能分析結(jié)果見圖3.

表3 GO分析項目信息Tab.3 Information of GO analysis

圖3 首烏藤與AD疾病潛在靶點GO功能分析Fig.3 GO function analysis map of Polygni multifloriCaulis and AD potential target

2.5 KEGG通路分析

2.5.1 KEGG信號通路富集分析結(jié)果

在DAVID平臺進行KEGG富集分析后共得到KEGG信號通路21條.將得到的21條信號通路按FDR<0.05限定進行篩選，得到篩選后的信號通路共3條，按FDR從小到大的順序排列，見表4.

表4 首烏藤作用于AD的KEGG信號通路信息Tab.4 Information of the signal pathways by KEGG ofPolygni multiflori Caulis acting on AD

2.5.2 成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將KEGG信號通路分析所得到的FDR<0.05的信號通路進行整理，獲取其相關(guān)的靶點信息.將首烏藤成分、信號通路、相關(guān)靶點信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中構(gòu)建藥物成分-靶點-重要通路網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4.

圖4 首烏藤與富集所得通路共同映射的成分靶點及疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Target maps and disease target maps mapped together in the compatibility of Polygni Multiflori Caulis注:藍(lán)色代表信號通路；黃色代表首烏藤成分；桃紅色代表信號通路與成分疾病共同靶點基因

2.6 首烏藤與AD共同作用靶點-重要信號通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將與AD相關(guān)的血清素能突觸信號通路、鈣信號通路、神經(jīng)配體-受體相互作用信號通路單獨與藥物疾病共同作用靶點進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，見圖5.重要信號通路及其對應(yīng)的基因見表5.

圖5 首烏藤成分與AD共同作用靶點-重要信號通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Network map of targets and important pathways in combination of Polygni multiflori Caulis and AD注：藍(lán)色代表重要信號通路；桃紅色代表成分疾病共同靶點基因

表5 AD相關(guān)重要通路對應(yīng)靶點信息Tab.5 Information of targets of AD-related important signal pathways

3 討論

到目前為止，AD病因及發(fā)病機制尚未完全明確，一般認(rèn)為遺傳因素、免疫因素、環(huán)境因素等在內(nèi)的多種因素都參與致病.AD的發(fā)病機制主要有β淀粉樣蛋白(beta-amyloid, Aβ)學(xué)說、Tau過度磷酸化學(xué)說、神經(jīng)血管學(xué)說、膽堿能學(xué)說、免疫炎癥學(xué)說以及氧化應(yīng)激學(xué)說等多種學(xué)說[15-17].其主要病理表現(xiàn)為腦組織中的老年斑(senile plaque, SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle, NFT)、大量營養(yǎng)不良性神經(jīng)炎及神經(jīng)元功能受損，其最主要的臨床癥狀為進行性認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)精神和行為學(xué)功能失調(diào)，以致最終喪失生活能力為主要臨床表現(xiàn).其中老年斑主要由毒性Aβ在神經(jīng)細(xì)胞外聚集引起；NFT主要以雙螺旋絲(paired helical filaments, PHFs)樣結(jié)構(gòu)存在.已有研究表明：一過性的Tau蛋白磷酸化對神經(jīng)具有保護作用，而異常過度磷酸化的Tau蛋白可形成雙螺旋絲樣結(jié)構(gòu)，構(gòu)成NFT[18].Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，它能與微管蛋白結(jié)合促進其聚合形成微管.而Tau蛋白與管蛋白結(jié)合成為微管蛋白可作為微管組裝早期的核心，進而促進其他微管蛋白在此核心上延伸聚集形成微管參與各種生理活動[19].

在AD的發(fā)病過程中涉及多因素、多機制以及多條細(xì)胞信號通路的參與.而目前臨床上治療AD療效顯著的藥物則報道不多，現(xiàn)有臨床藥物多僅能緩解輕中度AD的臨床癥狀且作用機制單一.而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、信息學(xué)等多個學(xué)科綜合而成的研究方法，能對多組分、多靶點、多通路進行分析，且與中醫(yī)用藥的整體性有很大的相似性，適合用于研究AD這類多因素致病的疾病[20].

本文篩選得到首烏藤有效成分14種，其中8種成分對血腦屏障有著較好的通透性，6種成分則通透性較低.首烏藤有效成分與AD疾病共同作用的靶點為50個，占總AD相關(guān)靶點(228個)的21.93%，首烏藤對AD靶點的映射率較好.因此首烏藤能通過多個靶點作用于AD并可產(chǎn)生較好的防治作用.

對首烏藤成分-成分疾病作用靶點構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)后，得到自由度最高的前4個基因節(jié)點分別為ACHE、ADORA2A、ESR2、MAOA.這4種基因所表達(dá)的蛋白廣泛參與AD的發(fā)病發(fā)生發(fā)展過程中.目前認(rèn)為：ACHE是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中抗AD最常用的藥物靶點之一，ACHE的表達(dá)產(chǎn)物為乙酰膽堿酯酶(AChE).臨床上常使用AChE抑制劑治療AD，其作用機制主要是抑制AChE以減少突觸間隙中乙酰膽堿的失活，從而提高乙酰膽堿水平，促進膽堿能神經(jīng)的傳遞，以此改善AD患者的認(rèn)知功能[21].在首烏藤有效成分中SWT1、SWT2、SWT5、SWT6、SWT8、SWT9、SWT11、SWT14均可對ACHE基因產(chǎn)生影響.因此，通過抑制AChE可能是首烏藤防治AD的作用機制之一.

腺苷是人體內(nèi)重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，近年研究表明：腺苷的受體功能失衡參與了AD的發(fā)病.在AD患者腦中腺苷A1受體(ADORA1)表達(dá)減少而腺苷A2A受體(ADORA2A)過度表達(dá)，且ADORA1介導(dǎo)的抑制作用減弱，ADORA2A介導(dǎo)的興奮作用增強，通過各自的信號通路引起相應(yīng)神經(jīng)病理變化，從而導(dǎo)致AD的發(fā)生[22].首烏藤可能從降低ADORA2A的表達(dá)進而恢復(fù)受體功能失衡這一層面影響并發(fā)揮了治療AD的發(fā)生.

ESR2基因編碼能產(chǎn)生雌激素受體β(ERβ).而ERβ與其另外一個亞基雌激素受體α(ERα)在人體內(nèi)分布有差異，其發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)也不完全相同.研究表明：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中ERβ有較高豐度的表達(dá)，而ERα低表達(dá)或無表達(dá)[23-24].在中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的局部雌激素與AD的發(fā)生密切相關(guān)，其功能可能為促進大腦海馬區(qū)樹突棘的發(fā)育、拮抗毒性Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)元毒性以及影響Tau的磷酸化水平進而延緩AD的發(fā)生發(fā)展[25].因此，首烏藤可能通過影響ESR2基因表達(dá)，進而提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部ERβ的豐度從而達(dá)到治療AD的作用.

在AD的發(fā)病機制中，毒性Aβ除了可聚集形成老年斑之外，還參與到其他多條發(fā)病機制當(dāng)中.如毒性Aβ可作用于神經(jīng)細(xì)胞膜，引發(fā)鈣超載，細(xì)胞內(nèi)Ca2+大量增多會激活單胺氧化酶A(MAO-A)，MAO-A可產(chǎn)生過氧化物和自由基，造成對神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損害[26].因此，針對MAO-A的活性進行調(diào)節(jié)以減少氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的神經(jīng)損傷可能是首烏藤治療AD的可能機制之一.

KEGG通路富集分析篩選后得到3條重要通路，即血清素能突觸信號通路、Ca2+信號通路以及神經(jīng)配體-受體相互作用信號通路.神經(jīng)配體-受體相互作用信號通路與AD的發(fā)生密切相關(guān)，該通路的調(diào)節(jié)主要利用5-HT、ACh、多巴胺、GABA等神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)作為前體物質(zhì)，進而影響后續(xù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[27].

血清素即5羥色胺(5-HT)，血清素能系統(tǒng)與AD的發(fā)病也密切相關(guān).研究表明，5-HT4及5-HT6受體(即5-HT receptor 6, 5-HTR6)參與了Tau蛋白過度磷酸化的過程[28].而5-HTR6與配體結(jié)合可激活M1R介導(dǎo)的信號通路，以減少毒性Aβ的沉積.此外，長期使用5-HT4受體的激動劑可使AD模型小鼠腦內(nèi)毒性Aβ沉積減少，神經(jīng)纖維纏結(jié)與老年斑形成下降，Aβ導(dǎo)致的氧化應(yīng)激所帶來的損傷也相應(yīng)得到緩解[29].而5-HT7受體的激活能對海馬神經(jīng)元的凋亡產(chǎn)生抑制作用，并使突觸的可塑性增強[30].進一步探索首烏藤是否能通過激活血清素能受體從而延緩AD的發(fā)生也是一個重要的思路.

Ca2+信號通路與機體各種疾病的發(fā)生發(fā)展都密切相關(guān).在AD中，Ca2+能與毒性Aβ協(xié)同促進AD發(fā)生，而毒性Aβ導(dǎo)致的鈣超載能刺激細(xì)胞產(chǎn)生更多的氧自由基，加重神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷.同時，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的失衡還會加速毒性Aβ的聚集，進一步促進AD的發(fā)生[31].經(jīng)預(yù)測發(fā)現(xiàn)首烏藤有12種有效成分都能通過鈣信號通路來達(dá)到治療AD的目的.

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探索了首烏藤治療AD的作用靶點及其可能的作用機制，證明了中草藥首烏藤具有多種活性成分，能通過影響多個靶點、多條信號通路的方式作用于AD疾病發(fā)生過程中的各個病理生理學(xué)過程，從而達(dá)到治療AD或延緩其發(fā)生發(fā)展的作用.其具體機制可能主要與上調(diào)ACh水平、抑制Aβ形成、抑制鈣超載與氧化應(yīng)激、增強突觸可塑性等有關(guān).本文可為后續(xù)的實驗設(shè)計和研究思路提供一定的理論依據(jù)和研究思路，所分析的首烏藤治療AD重要靶點基因及其重要信號通路，還需進一步的細(xì)胞實驗和動物實驗進行驗證.