芍藥苷對2型糖尿病模型大鼠心肌損傷的改善作用及機(jī)制研究

李姍姍 田春雨 張國偉 馬雷雷 李繼安 劉佳璇 劉穎 李爽 李小龍 沈佳歡

中圖分類號 R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）23-2846-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.23.06

摘 要 目的：研究芍藥苷對2型糖尿?。═2DM）模型大鼠心肌損傷的改善作用及機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常組、模型組、陽性對照組（二甲雙胍 90 mg/kg）和芍藥苷高、中、低劑量組（90、60、30 mg/kg），每組8只大鼠。除正常組外，其余各組大鼠均通過飼以高糖高脂飼料+腹腔注射鏈脲佐菌素（30 mg/kg）的方法建立T2DM模型。造模成功后，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥液，正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。測定大鼠體質(zhì)量、空腹血糖值并進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn);測定大鼠血清中糖化血清蛋白（GSP）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）水平，觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化，檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，并分別采用免疫組化法和Western blot法檢測大鼠心肌組織中B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（caspase-3）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量和血清中GSH-Px、SOD水平以及心肌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），空腹血糖值、血糖曲線下面積、血清中生化指標(biāo)（GSP、TC、TG、MDA、CK-MB、cTnⅠ）水平、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和心肌組織中Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高或增加（P<0.05或P<0.01）;心肌組織排列相對不規(guī)則，部分肌纖維斷裂。與模型組比較，除芍藥苷低劑量組大鼠體質(zhì)量和血清中SOD、MDA水平以及心肌組織中Bax蛋白表達(dá)水平外，芍藥苷各劑量組大鼠的上述指標(biāo)水平均得到顯著回調(diào)（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：芍藥苷可調(diào)節(jié)T2DM模型大鼠的糖脂代謝、增強(qiáng)其抗氧化能力、抑制其心肌細(xì)胞凋亡，對其心肌損傷具有一定的改善作用;該作用的分子機(jī)制可能與上調(diào)心肌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)心肌組織中Bax、caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 芍藥苷;2型糖尿病;心肌損傷;細(xì)胞凋亡

Study on Improvement Effects and Mechanism of Paeoniflorin on Myocardial Injury in Type 2 Diabetic Model Rats

LI Shanshan1，TIAN Chunyu1，2，3，ZHANG Guowei1，MA Leilei1，LI Ji’an2，3，LIU Jiaxuan2，LIU Ying2，LI Shuang1，LI Xiaolong2，SHEN Jiahuan2（1. College of Pharmacy， North China University of Science and Technology， Hebei Tangshan 063210， China; 2. College of Traditional Chinese Medicine， North China University of Science and Technology， Hebei Tangshan 063210， China; 3. Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine in Prevention and Treatment of Diabetes and Its Complications in Hebei Province， Hebei Tangshan 063210， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of paeoniflorin （PF） on myocardial injury in type 2 diabetes mellitus （T2DM） model rats and its mechanism. METHODS： The experiment was set up in the normal group， model group， positive control group （metformin 90 mg/kg）， PF high-dose， medium-dose and low-dose groups （90， 60， 30 mg/kg）， with 8 rats in each group. Except for normal group， other groups were given high-glucose and high-fat diet and intraperitoneal injection of streptozotocin （30 mg/kg） to induce T2DM model. After modeling， administration groups were given relevant medicine intragastrically， normal group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 4 weeks. The body weight， fasting blood glucose and oral glucose tolerance were measured; serum levels of glycosylated serum protein （GSP）， total cholesterol （TC）， triacylglycerol （TG）， glutathione peroxidase （GSH-Px），superoxide dismutase （SOD），malondialdehyde （MDA）， creatine kinase isoenzyme-MB （CK-MB） and troponin Ⅰ （cTnⅠ） were determined. The pathomorphological changes of myocardium were observed. The apoptosis index of rat cardiomyocytes was detected. The protein expression of B-cell lymphoma 2 （Bcl-2）， Bcl-2 related X protein （Bax） and caspase-3 in rat myocardium were detected by immunohistochemistry and Western blot. RESULTS： Compared with normal group， the body weight， serum levels of GSH-Px and SOD， protein expression of Bcl-2 in myocardium were decreased significantly in model group （P<0.01）; while fasting blood glucose， area under blood glucose curve， serum levels of biochemical indexes （GSP，TC，TG，MDA，CK-MB， cTnⅠ）， cardiomyocyte apoptosis index， protein expression of Bax and caspase-3 in myocardium were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The arrangement of myocardium was relatively irregular， and some muscle fibers were broken. Compared with model group， except for body weight， serum levels of SOD and MDA， the protein expression of Bax in myocardium in PF low-dose group， above indexes of PF groups were reversed significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： PF can regulate glycolipid metabolism， enhance antioxidant ability， inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve myocardial injury in T2DM model rats; the mechanism may be associated with increasing the protein expression of Bcl-2 and down-regulating the protein expression of Bax and caspase-3 in myocardium.

KEYWORDS? ?Paeoniflorin; Type 2 diabetes mellitus; Myocardial injury; Apoptosis

糖尿病是以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，其中2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）作為最常見的糖尿病類型，占所有糖尿病病例的90%以上[1]。目前，糖尿病引發(fā)的各種并發(fā)癥（如糖尿病誘發(fā)的心血管疾?。┮殉蔀樘悄虿』颊叩闹饕劳鲈騕2]。研究表明，T2DM可造成心肌胰島素敏感性下降、心肌細(xì)胞氧化損傷，進(jìn)而威脅心臟功能[3];同時(shí)，T2DM也會加劇左心室肥厚的發(fā)展，增加心臟對缺血性損傷的易感性[4]。由于心肌損傷是許多心臟疾病的共同基礎(chǔ)，故研發(fā)出可以防治T2DM誘導(dǎo)的心肌損傷的藥物對于減緩T2DM相關(guān)心臟疾病的進(jìn)展具有重要意義。

芍藥苷是從芍藥根中提取得到的一種單萜糖苷類化合物，是芍藥根的主要活性成分之一[5-6]。其分子式為C23H28O11，為無定形類白色粉末，具有吸濕性，熔點(diǎn)為196 ℃[7]。藥動學(xué)研究顯示，芍藥苷具有易吸收、口服生物利用度高等特點(diǎn)[8]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、擴(kuò)張血管等藥理作用[9]。此外，芍藥苷被證明可以減輕心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心臟的水腫、降低其心肌梗死發(fā)生率等[10-12]，具有較好的心肌保護(hù)作用。

T2DM誘導(dǎo)心肌損傷的機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為可能的損傷機(jī)制有氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥等[13]。有研究表明，在高血糖狀態(tài)下促凋亡蛋白——B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）相關(guān)X蛋白（Bax）可被活化，并且Bax/Bcl-2的比值會降低，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡[14]。另有研究表明，在糖尿病狀態(tài)下線粒體細(xì)胞色素C會被誘導(dǎo)釋放，進(jìn)而促使胱天蛋白酶3（caspase-3）激活，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[15]。因此，本研究擬考察芍藥苷對T2DM模型大鼠心肌損傷的保護(hù)作用，并從Bax/Bcl-2/caspase-3信號通路角度初步研究芍藥苷改善T2DM模型大鼠心肌損傷的分子機(jī)制，為芍藥苷的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有GA-3型穩(wěn)益血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司），PowerEase Touch 350W型電泳儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、ChemiDoc TMC XRS+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），TP1020型組織脫水機(jī)、RM2245型組織切片機(jī)（德國Leica公司），M200PR0型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司），BX53型顯微鏡、SZX71型熒光體式顯微成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.2 主要藥品與試劑

芍藥苷原料藥（批號D1016A，純度>98%）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;鹽酸二甲雙胍片（批號H20023370，規(guī)格為0.5 g/片）購自中美上海施貴寶制藥有限公司;高糖高脂飼料（批號21031004）、鏈脲佐菌素（STZ，批號18883-66-4）均購自北京博愛港生物技術(shù)有限公司;糖化血清蛋白（GSP）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（批號分別為20210402、20200110、20200110、20210528、20210601、20210602）均購自南京建成生物工程研究所;肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）試劑盒（批號202104）購自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司;大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）ELISA試劑盒（批號05/2021）購自廈門侖昌碩生物科技有限公司;蘇木精、伊紅染色試劑盒（批號分別為C210302、C201102）均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司;通用型免疫組化SP試劑盒（批號2131C0804）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;&nbsp; TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒（批號分別為110919201008、092820210207）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔源β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號9100026001）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;兔源Bax單克隆抗體、兔源Bcl-2單克隆抗體、兔源caspase-3多克隆抗體（批號分別為GR3325129-1、GR3275117-8、GR224831-1）均購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號BST13J17B16G56）購自武漢博士德生物工程有限公司;其余試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為雙蒸水。

1.3 動物

本研究所用的動物為SPF級健康SD雄性大鼠，共60只，鼠齡為4周齡，體質(zhì)量為115～125 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2020-0004。大鼠購入后飼養(yǎng)于溫度22～25 ℃、相對濕度40%～60%的動物房中。本研究中動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查批準(zhǔn)后實(shí)施（批準(zhǔn)號為LX2019084）。

2 方法

2.1 T2DM大鼠模型的建立

將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后分為正常組（n=8）和造模組（n=52）。正常組大鼠飼以正常飼料，造模組大鼠飼以高糖高脂飼料。飼養(yǎng)4周后，造模組大鼠一次性腹腔注射30 mg/kg STZ溶液（pH=4.4），正常組大鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。3 d后，檢測造模組大鼠的空腹血糖值，以空腹血糖值≥11.1 mmol/L為判斷T2DM模型構(gòu)建成功的標(biāo)準(zhǔn)[16]。結(jié)果，本研究的成模率約為92%（共有48只大鼠建模成功）。

2.2 動物分組與給藥

將造模成功的40只大鼠按隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為模型組、陽性對照組（二甲雙胍90 mg/kg[16]）和芍藥苷高、中、低劑量組（90、60、30 mg/kg[17]），每組8只。正常組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥液（均以生理鹽水為溶劑溶解），灌胃體積均為7.5 mL/kg，每天1次，連續(xù)4周。灌藥期間正常組大鼠繼續(xù)飼以正常飼料，其余各組大鼠均繼續(xù)飼以高糖高脂飼料。

2.3 體質(zhì)量、空腹血糖值測定和口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

在灌胃前及灌胃第1、2、3、4周時(shí)，分別測定大鼠體質(zhì)量。在灌胃前和灌胃第4周時(shí)，分別測定大鼠的空腹血糖值（空腹血糖值測定前，大鼠先禁食不禁水12 h）。在第4周灌胃結(jié)束后進(jìn)行大鼠口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)：按2 g/kg的劑量灌胃大鼠50%葡萄糖注射液，分別于灌胃葡萄糖注射液后第0、15、30、45、60、120 min時(shí)測定大鼠血糖值，并計(jì)算血糖的曲線下面積（AUC）：AUC=[（血糖值0 min+血糖值30 min）×15/60+（血糖值30 min+血糖值60 min）×15/60+（血糖值60 min+血糖值120 min）×30/60][18]。

2.4 樣本取材及處理

口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)后，于大鼠腹主動脈采血5 mL，然后以3 000 r/min離心血樣10 min，收集血清，于 -80 ℃保存，備用。取血后，將大鼠處死，取其心肌組織，以冰生理鹽水沖洗后用濾紙吸干。將一部分心肌組織置于4%多聚甲醛溶液中浸泡24 h;將另一部分心肌組織放入20%蔗糖溶液中;將剩余的心肌組織迅速置于液氮中保存，然后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱中長期保存，備用。

2.5 血清中生化指標(biāo)測定

取“2.4”項(xiàng)下血清，分別測定血清中血脂指標(biāo)（GSP、TC、TG）、氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)（GSH-Px、SOD、MDA）和心肌損傷特異性診斷指標(biāo)（CK-MB、cTnⅠ）的水平。上述指標(biāo)的測定均按照對應(yīng)試劑盒說明書方法操作。

2.6 心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法進(jìn)行觀察。取“2.4”項(xiàng)下于4%多聚甲醛溶液中浸泡24 h的大鼠心肌組織，常規(guī)制備石蠟切片（厚度為4 μm），然后行常規(guī)HE染色。將染色后的組織切片置于顯微鏡下觀察（心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色、細(xì)胞質(zhì)呈紅色）。

2.7 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)測定

每組隨機(jī)選取3個(gè)樣本，采用TUNEL染色法進(jìn)行測定。取“2.4”項(xiàng)下于20%蔗糖溶液中保存的大鼠心肌組織，用OTC包埋劑包埋后冰凍切片，將切片用4%多聚甲醛溶液固定30 min;用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，加入含0.5%Triton X-100的PBS，于室溫孵育5 min;用PBS洗滌2次，滴加TUNEL檢測液，于37 ℃避光孵育60 min;用DAPI封片，然后置于熒光體式顯微鏡下觀察（凋亡細(xì)胞呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光）。采用Image J 1.46r軟件記錄每個(gè)視野中的凋亡細(xì)胞數(shù)量和總細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)：凋亡指數(shù)（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%[19]。

2.8 心肌組織中Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)測定

2.8.1 免疫組化法測定 每組隨機(jī)選取3個(gè)樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按“2.6”項(xiàng)下方法制備石蠟切片，以二甲苯和梯度乙醇進(jìn)行脫蠟和水合后，滴加EDTA溶液進(jìn)行抗原修復(fù);滴加3%過氧化氫溶液，于室溫靜置15 min;用PBS沖洗3次、每次5 min，然后加入Bax一抗（稀釋比例1 ∶ 1 000）、Bcl-2一抗（稀釋比例1 ∶ 2 000）、caspase-3一抗（稀釋比例1 ∶ 5 000），于4 ℃孵育過夜;滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG二抗，于室溫孵育10 min;用PBS沖洗3次、每次5 min，進(jìn)行DAB顯色，然后以蘇木精復(fù)染;用水沖洗后，再進(jìn)行脫水、封片，然后將組織切片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察（目標(biāo)蛋白的陽性表達(dá)呈棕褐色），并采用Image J 1.46r軟件分析各蛋白的平均光密度值（平均光密度值越大，表示蛋白表達(dá)水平越高）。

2.8.2 Western blot法測定 每組隨機(jī)選取3個(gè)樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取“2.4”項(xiàng)下凍存的大鼠心肌組織，加入 RIPA裂解液提取組織中的總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒說明書方法測定蛋白的質(zhì)量濃度后，將蛋白在100 ℃條件下加熱變性。取變性后蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（分離膠電壓80 V，濃縮膠電壓120 V，電泳時(shí)間105 min），然后電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上（電流220 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1 h），加入牛血清白蛋白（BSA）封閉液封閉2 h;用TBST洗膜3次、每次10 min，分別加入β-actin一抗（稀釋比例1 ∶ 1 000）、Bax一抗（稀釋比例1 ∶ 1 000）、Bcl-2一抗（稀釋比例1 ∶ 2 000）和caspase-3一抗（稀釋比例1 ∶ 5 000），于4 ℃孵育過夜;用TBST洗膜3次、每次10 min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG二抗（稀釋比例1 ∶ 10 000），于室溫孵育2 h;用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影、曝光。使用Image Lab 5.2.1軟件測定各蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析;若方差齊時(shí)兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊時(shí)兩組間比較采用Tamhane’s檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量測定結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)期間，正常組大鼠的體質(zhì)量呈上升趨勢，而模型組和各給藥組大鼠的體質(zhì)量均呈下降趨勢。灌胃前和灌胃第1周時(shí)，各組大鼠的體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。灌胃第2周時(shí)，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，陽性對照組和芍藥苷高劑量組大鼠體質(zhì)量均顯著升高（P<0.05）。灌胃第3、4周時(shí)，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠體質(zhì)量均顯著升高（P<0.01）。各組大鼠的體質(zhì)量測定結(jié)果見圖1。

3.2 空腹血糖值和血糖AUC測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠灌胃前和灌胃第4周時(shí)的空腹血糖值均顯著升高（P<0.01），血糖AUC顯著增大（P<0.01）。灌胃第4周時(shí)，與模型組比較，陽性對照組和芍藥苷高、中劑量組大鼠的空腹血糖值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），芍藥苷高、中、低劑量組大鼠的血糖AUC均顯著減?。≒<0.05或P<0.01）。各組大鼠的空腹血糖值和血糖AUC測定結(jié)果見表1。

3.3 血清中GSP、TC、TG水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中GSP、TC、TG水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠血清中上述指標(biāo)水平均顯著降低（P<0.01）。各組大鼠血清中GSP、TC、TG水平測定結(jié)果見表2。

3.4 血清中GSH-Px、SOD、MDA水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中GSH-Px、SOD水平均顯著降低（P<0.01），MDA水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中GSH-Px、SOD（除芍藥苷低劑量組外）水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），血清中MDA水平（除芍藥苷低劑量組外）均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠血清中GSH-Px、SOD、MDA水平測定結(jié)果見表3。

3.5 血清中CK-MB、cTnⅠ水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中CK-MB、cTnⅠ水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠血清中CK-MB水平以及芍藥苷各劑量組大鼠血清中cTnⅠ水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠血清中CK-MB、cTnⅠ水平測定結(jié)果見表4。

3.6 心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

正常組大鼠心肌組織排列規(guī)則，心肌細(xì)胞完整，無肌纖維斷裂。與正常組比較，模型組大鼠心肌組織排列相對不規(guī)則，肌束間隔增寬，部分肌纖維斷裂。與模型組比較，陽性對照組和芍藥苷高劑量組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化明顯改善，心肌組織排列較為整齊;芍藥苷中、低劑量組大鼠肌束間隔增寬的幅度明顯減小，部分肌纖維斷裂。各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)顯微圖見圖2。

3.7 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著降低（P<0.01）。各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況顯微圖見圖3，凋亡指數(shù)測定結(jié)果見表5。

3.8 心肌組織中Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)測定結(jié)果

3.8.1 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠心肌組織中Bax、caspase-3蛋白的平均光密度值均顯著升高（P<0.01），Bcl-2蛋白的平均光密度值顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織中Bax、caspase-3蛋白的平均光密度值均顯著降低（P<0.05或 P<0.01），Bcl-2蛋白的平均光密度值均顯著升高（P<0.05或 P<0.01）。各組大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)的免疫組化圖見圖4，平均光密度值測定結(jié)果見表6。

3.8.2 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠心肌組織中Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織中Bax（除芍藥苷低劑量組外）、caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)的電泳圖見圖5，蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果見表7。

4 討論

T2DM的主要臨床癥狀是高血糖和胰島素抵抗，而胰島素分泌功能異?？赡軙龠M(jìn)心血管病變，造成心肌損傷，進(jìn)而對心臟功能產(chǎn)生有害影響[20]。二甲雙胍作為傳統(tǒng)的降糖基礎(chǔ)藥物，可使糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)降低32%，也可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡來介導(dǎo)對心肌組織的保護(hù)作用[20-21]。因此，本研究以二甲雙胍為陽性對照藥物。本研究結(jié)果顯示，芍藥苷可明顯改善T2DM模型大鼠的血糖（如空腹血糖值、血糖AUC水平）、血脂（如TC、TG等）紊亂，表明其具有調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用。

心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心臟重塑和心力衰竭的主要原因;同時(shí)，由于心肌細(xì)胞再生能力有限，其損傷后會損害心臟的結(jié)構(gòu)和功能[22]。有研究表明，心肌細(xì)胞凋亡在心肌損傷的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用——心肌細(xì)胞凋亡可以阻止T2DM引起的心肌損傷的進(jìn)展[23]。本研究中TUNEL染色結(jié)果顯示，芍藥苷能夠顯著減少T2DM模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡;氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)測定結(jié)果顯示，芍藥苷能夠顯著升高T2DM模型大鼠血清中GSH-Px、SOD水平，降低其血清中MDA水平，表明芍藥苷可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對心肌組織產(chǎn)生保護(hù)作用。

CK-MB、cTnⅠ主要分布于心肌細(xì)胞中，是心肌疾病的常見診斷指標(biāo);特別是CK-MB，其作為心肌損傷的特異性指標(biāo)，當(dāng)心肌組織受損時(shí)，細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致血清中CK-MB水平升高[24]。本研究結(jié)果顯示，芍藥苷能夠降低T2DM模型大鼠血清中CK-MB、cTnⅠ水平;同時(shí)，HE染色結(jié)果顯示，與模型組比較，芍藥苷各劑量組大鼠心肌組織的病理形態(tài)學(xué)變化均得到不同程度改善，表明芍藥苷對T2DM模型大鼠的心肌損傷具有抑制作用。

在高糖高脂環(huán)境下，心肌細(xì)胞會產(chǎn)生大量的晚期糖基化終末產(chǎn)物、聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶等，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生異常凋亡[25]。Bcl-2和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子：Bax過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而Bcl-2可與Bax形成二聚體，抑制Bax的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡[26-27]。caspase-3是caspase家族蛋白中細(xì)胞凋亡的效應(yīng)者，當(dāng)caspase-3被激活后，可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程[28]。本研究通過免疫組化和Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可下調(diào)T2DM模型大鼠心肌組織中Bax、caspase-3蛋白的表達(dá)，上調(diào)T2DM模型大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)，表明芍藥苷可通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來改善T2DM模型大鼠的心肌損傷。

綜上所述，芍藥苷可調(diào)節(jié)T2DM模型大鼠的糖脂代謝、增強(qiáng)其抗氧化能力、抑制其心肌細(xì)胞凋亡，對其心肌損傷具有一定的改善作用;該作用的分子機(jī)制可能與上調(diào)心肌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)心肌組織中Bax、caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2021-07-18 修回日期：2021-10-22）

（編輯：林 靜）