中草藥中毒性吡咯里西啶類生物堿分析方法研究進(jìn)展及控制現(xiàn)狀

馬躍新，馮有龍，吳嫣艷，周娟娟，張 瑩，楊 靜，曹 玲*，黃 青*

·綜 述·

中草藥中毒性吡咯里西啶類生物堿分析方法研究進(jìn)展及控制現(xiàn)狀

馬躍新1, 2，馮有龍2，吳嫣艷2，周娟娟2，張 瑩1, 2，楊 靜1, 2，曹 玲2*，黃 青2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，江蘇 南京 210019

吡咯里西啶類生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是一類種類繁多、分布廣泛的植物內(nèi)源性毒性成分，具有不同程度的肝毒性、遺傳毒性和致癌性。目前已在約3%的開花植物中鑒定出600余種PAs及其氮氧化物。對可能含有毒性PAs的中草藥，尤其是《中國藥典》2020年版收錄的品種進(jìn)行了詳盡梳理，對PAs的基本結(jié)構(gòu)、植物來源和各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)對其風(fēng)險評估和限值制定情況，以及近年來分析方法的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對其定性和定量分析中的難點進(jìn)行討論，對毒性PAs的監(jiān)控提出建議，旨在為毒性PAs的檢測研究、監(jiān)管部門的政策制定提供警示和參考依據(jù)。

吡咯里西啶類生物堿；中草藥；風(fēng)險評估；限量；分析方法；安全性控制

吡咯里西啶類生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是已知最有效的天然植物性防御毒素之一，被用于抵御昆蟲、食草動物等侵害，廣泛分布于6000多種植物中，并可經(jīng)食物鏈傳遞[1-2]。近年來，PAs及其相應(yīng)的氮氧化物（PA-oxides，PANOs）已被證明表現(xiàn)出多種毒理學(xué)效應(yīng)，包括肝毒性、遺傳毒性和致癌性等[3-5]。在我國，由于可能含PAs類毒性成分的部分中草藥在臨床多有使用、民間習(xí)用較為廣泛，相關(guān)的肝損傷如肝竇阻塞綜合征等病例報道逐年增加[3,6]；因服用含毒性PAs的中草藥或制品等致的嚴(yán)重中毒病例在許多其他國家也有報道[7]，因此，其已引起各國食品藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)的高度重視。

鑒于PAs具有種類多樣性、分布廣泛性、低攝入量下的高毒性特征，本文對PAs的基本結(jié)構(gòu)、植物來源、《中國藥典》2020年版收錄情況和各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)對其風(fēng)險評估和限值制定情況，以及近年來分析方法的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對其定性和定量分析中的難點進(jìn)行討論，對毒性PAs的監(jiān)控提出建議，旨在為毒性PAs的檢測研究、監(jiān)管部門的政策制定提供警示和參考依據(jù)。

1 PAs的結(jié)構(gòu)、分類及毒性

1.1 PAs的結(jié)構(gòu)類型

PAs是由雙稠吡咯烷衍生的氨基醇和植物中的有機(jī)酸經(jīng)酯化形成的。PAs的基本結(jié)構(gòu)單元為千里光次堿（雙稠吡咯環(huán)部分）和千里光次酸（有機(jī)酸部分），在植物中以游離生物堿及其氮氧化物形式存在，一種植物可能含有多種PAs和PANOs，其基本結(jié)構(gòu)見圖1。千里光次堿的吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)為PAs的母核，按照其1,2位不飽和雙鍵存在與否，可分為飽和、不飽和型，圖2列出了其中代表性化合物的結(jié)構(gòu)，飽和型PAs主要為闊葉千里光次堿，不飽和型PAs主要有倒千里光裂堿型、天芥菜定型、奧托尼堿型、仰臥天芥菜定型、crotanecine型5種[8]。千里光次酸一般為5～10個碳原子的一元酸或二元酸，可同千里光次堿7或9位的羥基形成單酯、開鏈雙酯或大環(huán)雙酯[9]（圖3）。

圖1 PAs (A) 和PANOs (B) 的基本結(jié)構(gòu)

圖2 代表性飽和 (A) 和不飽和型 (B) 千里光次堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖3 代表性單酯型 (A)、開鏈雙酯型(B) 和大環(huán)雙酯型(C) 千里光次酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2 PAs的結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系

PAs的結(jié)構(gòu)與其毒性密切相關(guān)。研究顯示，吡咯環(huán)上的1,2位不飽和雙鍵是其毒性必需基團(tuán)，具有該類結(jié)構(gòu)的PAs（圖2-B），由于其直接靶器官為肝臟，通常有較強(qiáng)的肝毒性[10]，又稱肝毒性吡咯里西啶生物堿（hepatotoxic PAs，HPAs），如倒千里光裂堿型的倒千里光堿、野百合堿，天芥菜定型的天芥菜堿和奧托尼堿型的山岡橐吾堿等。此外，這些HPAs還會引起肺、腎等器官毒性，致突變、致癌等[8,11]。

PAs的毒性還受次酸上酯基的取代數(shù)目和空間位阻影響，一般認(rèn)為，在HPAs中，大環(huán)雙酯型PAs的毒性最強(qiáng)，其次是單酯型和開鏈雙酯型[8]。PAs與PANOs的毒性主要來自其在肝臟中形成的脫氫代謝產(chǎn)物脫氫吡咯（dehydropyrrolizidine alkaloids，DHPAs），化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖4，DHPAs是一種活性的烷基化試劑，有很強(qiáng)的親電性，與組織中親核性的蛋白質(zhì)、核酸或酶結(jié)合，從而產(chǎn)生毒性效應(yīng)[6]。

圖4 脫氫吡咯的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2 PAs的植物來源

據(jù)報道，作為一種植物次生代謝產(chǎn)物，全世界不同地區(qū)的6000多種開花植物含有PAs[12]。目前已鑒定出660多種PAs和PANOs，其中約一半具有毒性，集中在菊科（Compositae）、紫草科（Boraginaceae）、豆科（Leguminosae）和蘭科（Orchidaceae）植物中[12-13]。這些毒性PAs可能通過傳統(tǒng)草藥、膳食補充劑、功能性食品、飲料的直接攝入[14-15]或食物鏈的逐級傳遞，如牛奶、蜂蜜、肉類等被人體攝取[14,16]。

我國可能含有毒性PAs的藥用植物眾多，據(jù)Roeder[17]的調(diào)查顯示，有38種藥用植物含有HPAs。喬月[18]對《中國藥典》2015年版中386種中藥的檢測發(fā)現(xiàn)，271種檢出HPAs（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥0.1 μg/kg），而受到影響的成方制劑可能更多。湯俊等[19]對《中國藥典》2010年版中含HPAs中藥品種的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，部分中藥的民間代用品（如紫苑代用品山紫苑、三七代用品菊三七等）也含有HPAs。因此，對上述研究及其他報道中含HPAs的藥材品種、其中含有/檢出的主要毒性成分及《中國藥典》2020年版中涉及的成方制劑進(jìn)行了系統(tǒng)的整理和匯總（表1）?？梢钥闯?，現(xiàn)行藥典中的許多藥材品種，包括民間的習(xí)用品或代用品，確實存在HPAs污染的潛在風(fēng)險。

表1 含有HPAs的中草藥品種、基原及其成方制劑

續(xù)表1

藥材基原主要HPAs成分成方制劑文獻(xiàn) 藥典收錄品種 紫草新疆紫草Arnebia euchroma (Royle) Johnst.或內(nèi)蒙紫草A. guttata BungeO7-angeloylretronecine、倒千里光裂堿、天芥菜堿外傷如意膏、京萬紅軟膏、紫金錠等18,26 番瀉葉狹葉番瀉Cassia angustifolia Vahl或尖葉番瀉C. acutifolia Delile野百合堿、野百合堿氮氧化物、trichodesmine等荷丹片27 飛揚草飛揚草Euphorbia hirta L.intermedine、石松胺、千里光菲靈堿等現(xiàn)版藥典中無相關(guān)成方制劑18 地錦草地錦Euphorbia humifusa Willd.或斑地錦E. maculata L.intermedine、石松胺、石松胺氮氧化物等小兒瀉速停顆粒、腸炎寧片、腸炎寧糖漿等18 苦玄參苦玄參Picria fel-terrae Lour.克氏千里光堿、倒千里光裂堿、野百合堿等萬通炎康片、婦炎凈膠囊18 半枝蓮半枝蓮Scutellaria barbata D. Donintermedine、intermedine氮氧化物、石松胺氮氧化物等抗骨髓炎片、金蒲膠囊、茵山蓮顆粒等18 蜂蜜中華蜜蜂Apis cerana Fabricius或意大利蜂A. mellifera Linnaeus取決于蜜源植物常用輔料或炮制（蜜炙）用 民間使用品種 勝紅薊藿香薊Ageratum conyzoides L.石松胺無相關(guān)成方制劑17,28 白頭婆單葉佩蘭Eupatorium japonicum Thunb.石松胺、intermidine無相關(guān)成方制劑28-29 菊三七菊葉三七Gynura japonica (Thunb.) Juel.千里光菲靈堿、千里光寧堿等無相關(guān)成方制劑17,30 山紫菀蹄葉橐吾Ligularia fischeri (Ledeb.) Turcz.clivorine、ligularine、isoline無相關(guān)成方制劑19 洋甘菊西洋甘菊Matricaria recutita L.藍(lán)薊定、intermedine、倒千里光堿等無相關(guān)成方制劑31 東北鶴虱異刺鶴虱Lappula heteracantha (Ledeb.) Guerke石松胺、intermedine、acetylintermedine等無相關(guān)成方制劑19 牛至牛至Origanum vulgare L.天芥菜堿、藍(lán)薊定、毛果天芥菜堿氮氧化物等無相關(guān)成方制劑32

3 PAs的檢測分析

穩(wěn)定高效的提取方法以及可靠、高選擇性和高靈敏度的分析方法是解決含毒性PAs藥品和食品安全性問題的基礎(chǔ)。主要對含PAs樣品的前處理、定性分析、定量分析3個最關(guān)鍵的方面進(jìn)行介紹。

3.1 含PAs樣品的前處理

3.1.1 PAs的提取 PAs（尤其PANOs）是一類極性相對較強(qiáng)的堿性化合物，易溶于常用的提取溶劑如甲醇、乙醇和水。PAs在酸性條件下成離子態(tài)，因此適當(dāng)?shù)乃幔?.05～1.00 mol/L稀硫酸或鹽酸）化可提高提取效率[33]。早期也有使用極性較低的溶劑來提取PAs，但由于PANOs極性較大，在相對非極性的溶劑（如二氯甲烷）中較難溶解，可能會留在水相，因此需在提取過程中或分離后還原氮氧化物來得到總游離堿[34]。迄今為止，應(yīng)用最多的提取方法主要有索氏提取、浸漬、超聲、回流、微波輔助萃取等[20,33,35-36]，這些方法基于浸漬和滲濾的基本原理，區(qū)別在于工藝實現(xiàn)方式和具體的萃取條件等。溶劑萃取的條件對PAs的回收率有很大影響，其中溫度、溶劑性質(zhì)（pH、pa、離子強(qiáng)度等）、溶劑體積是影響萃取效率的重要參數(shù)[37]。

Lebada等[38]比較了款冬在幾種溶劑組成中提取克氏千里光堿和千里光寧堿的效果，發(fā)現(xiàn)10 g樣品在1 L、pH為2的甲醇-枸櫞酸水溶液（50∶50）中回流加熱15 min的產(chǎn)率最高；而在室溫下用pH為7的水?dāng)嚢璨⒂眉状佳娱L索氏提取時間（48 h）的效果最差。Schaneberg等[39]也證實了索氏提取時間過長會導(dǎo)致PAs和PANOS減少，游離堿比例增高。Kopp等[37]則采用了加速溶劑萃取的方法，考察了不同酸（磷酸、硫酸、甲酸、乙酸）和氨水在不同濃度（1%、5%）和不同溫度下對千里光、款冬和聚合草中PAs回收率的影響，與傳統(tǒng)萃取技術(shù)相比，加速溶劑萃取方法的提取時間（12～20 min）短、效率高、溶劑用量（20 g樣品僅需30 mL）少。

3.1.2 PAs的富集和凈化 在對PAs進(jìn)行痕量分析時，待測物濃度往往很低，難以直接測定，通常需要在萃取后增加富集和凈化步驟。固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）由于其易于操作、適用于復(fù)雜基質(zhì)、固定相材料多樣而被廣泛使用，幾種固相萃取填料如C8、C18和強(qiáng)陽離子交換（strong cation exchange，SCX），均已得到成功應(yīng)用[40]。C8、C18分離純化目標(biāo)PAs的同時，基質(zhì)中的其他共提物較多，影響后續(xù)檢測的選擇性和靈敏度。而SCX由于專屬性更強(qiáng)，目前已成為一種最常使用的工具，商業(yè)化的SCX-SPE柱已成功用于蜂蜜、高脂食品、中草藥等復(fù)雜基質(zhì)中PAs的痕量分析[21,41-42]，歐洲食品安全局在指導(dǎo)意見中也推薦使用SCX-SPE的方法對PAs提取物進(jìn)行凈化[43]。

SCX-SPE的另一優(yōu)點在于可以同時捕獲PAs和PANOs并特定洗脫，使用流程一般包括活化、平衡、上樣、洗滌、洗脫。先用甲醇預(yù)潤濕SPE小柱，然后使用0.05 mol/L鹽酸或稀硫酸（與樣品溶液相似的溶液）來平衡小柱，樣品提取物上樣并用水/甲醇洗滌去除干擾化合物，最后通過施加堿性條件洗脫所有形式的PAs。洗脫溶劑通常采用采用甲醇-10%氨水（75∶25）的混合物或低溫下氨飽和的甲醇。研究考察了不同SCX-SPE柱回收PAs的效率，回收率略有差異[44]，推薦使用硅膠基質(zhì)的苯磺酸基填料。

3.1.3 其他技術(shù) 為了更好地從不同基質(zhì)中提取PAs，一些其他技術(shù)也被應(yīng)用于含PAs樣品的前處理過程，如分散液-液微萃?。╠ispersive liquid–liquid microextraction，DLLME）由于其萃取效率高、有機(jī)溶劑使用少等特點而極具潛力。Celano等[45]建立了基于DLLME的超高效液相色譜-質(zhì)譜法（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UHPLC-MS）用于測定蜂蜜中的PAs，回收率在71%～102%，自述實際樣品中的分析結(jié)果與SPE相當(dāng)。QuEChERS法也可用于測定多種基質(zhì)中的PAs[46]，但該方法必須用鋅粉還原PANOs。QuPPe法則是QuEChERS的改進(jìn)方法，當(dāng)樣品在酸性介質(zhì)中用甲醇稀釋后，可同時回收游離堿和氮氧化物[47]。Luo等[24]將分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）作為固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）涂層，建立了PA-MIPs-SPME與UHPLC-MS聯(lián)用分析款冬花中4種PAs的方法，該法回收率（89.1%～104.7%）良好、具有較高的靈敏度，減少了有機(jī)溶劑的使用。上述方法尚未被廣泛采用，其使用材料的批次差異性、方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性，是否適合于標(biāo)準(zhǔn)化的法定檢驗，還有待進(jìn)一步驗證。

3.2 PAs的分析方法

PAs的分析方法主要有分光光度法、薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）、氣相色譜法（gas chromatography，GC）、液相色譜法（liquid chromatography，LC）以及近年來發(fā)展起來的GC-MS、LC-MS聯(lián)用技術(shù)。此外，核磁共振法（nuclear magnetic resonance，NMR）和免疫學(xué)方法等也有應(yīng)用。分光光度法和TLC法檢測PAs的原理都基于顯色反應(yīng)（如使用Ehrlich和Mattocks試劑），操作簡便，早期常有應(yīng)用，但存在檢出限較高、靈敏度低等問題[48-49]。NMR法靈敏度也是制約其應(yīng)用于PAs定量分析的主要瓶頸，但其強(qiáng)大的定性分析能力，以及能對樣品實現(xiàn)無損和無偏向性檢測，使之常用于進(jìn)一步鑒定PAs的結(jié)構(gòu)[50-51]。酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法則多用于PAs的毒理學(xué)研究，在PAs暴露的臨床診斷上具有很大潛力[52]。

PAs紫外吸收較弱，紫外檢測法難以滿足微量/ 痕量分析的要求。GC法可被應(yīng)用于除otonecines型外的其他PAs，但易發(fā)熱分解和生物堿單酯形成二酯[33]。由于PANOs在揮發(fā)所需的溫度下不穩(wěn)定，因此不易使用GC進(jìn)行分析。色譜-質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用，在分析PAs/PANOs時，不但可以定性定量已知PAs，還能提供未知PAs的相對分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)信息，由于其靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，已成為各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)對PAs檢測分析的首選方法。

3.2.1 PAs的定性分析 液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是中草藥、食品和生物樣品中PAs/PANOs結(jié)構(gòu)解析和確證最為有效的技術(shù)手段[15,35,53]。高分辨質(zhì)譜（飛行時間/軌道阱質(zhì)譜）因其超高分辨率下精確質(zhì)量數(shù)測定的優(yōu)勢，非常適用于未知PAs的結(jié)構(gòu)解析、樣品中PAs/PANOs高通量快速篩查等工作[30,53]。Crews等[54]以高分辨率飛行時間（time of flight，TOF）質(zhì)譜研究PAs在新疆千里光分解過程中的結(jié)構(gòu)變化，并使用自建數(shù)據(jù)庫對樣品中已知PAs及其結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行自動搜索。Zhang等[55]以超高效液相色譜-四極桿-軌道質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-Q-Orbitrap/ MS），利用PAs特征碎片以平行反應(yīng)監(jiān)測模式篩選出合適的前體離子或產(chǎn)物離子，建立了用于在無對照品的情況下鑒定和半定量野百合中幾種具有相同母核PAs的方法。將其總結(jié)為基于特征診斷碎片離子的PAs定性篩查策略。它以高分辨質(zhì)譜的MSn模式研究PAs的質(zhì)量碎裂模式；對已知不同類型PAs的二級特征離子進(jìn)行歸屬，并用其對未知樣品中PAs進(jìn)行“釣取”和進(jìn)一步鑒定；這些特征碎片離子還可作為平行反應(yīng)監(jiān)測模式下的定量離子，因此該策略具有很強(qiáng)的適用性。詳細(xì)梳理了文獻(xiàn)中報道的不同類型母核PAs對應(yīng)的特征碎片離子（圖5）。其中otonecine型PAs在/122、150、168處具有特征碎片離子[56]，闊葉千里光次堿型在PAs/122、140處有特征碎片離子[56]（可用于區(qū)分毒性PAs），倒千里光裂堿型PAs在/94、120、138處有特征碎片離子[57]，根據(jù)/118、136處的特征碎片離子，還可將倒千里光裂堿型PAs和PANOs區(qū)分開[36]。此外，PAs在電噴霧電離源中易形成[2M＋H]＋二聚體，其相對豐度甚至可以達(dá)到100%，也可用于區(qū)分PAs和PANOs[58]。

3.2.2 PAs的定量分析

（1）GC-MS聯(lián)用技術(shù)：對PAs的定量分析，常用DB-1、DB-5、ZB-5等類型的毛細(xì)管色譜柱[42,59,60]和電子電離模式。由于PANOs在揮發(fā)所需的溫度下不穩(wěn)定，不能直接進(jìn)行分析，需要通過適當(dāng)?shù)倪€原和衍生化步驟將PANOs和PAs轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的PA母核進(jìn)行測定，由此產(chǎn)生了一種新的分析策略，稱為求和參數(shù)法。

圖5 倒千里光裂堿型 (A)、奧托尼堿型 (B)、闊葉千里光次堿型(C) PAs/PANOs的特征質(zhì)量碎裂途徑

求和參數(shù)法最早由Kempf等[42,61]提出，其分析PAs/PANOs的具體步驟如圖6所示，通過在前處理時將所有倒千里光裂堿型不飽和PAs/PANOs轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的核心結(jié)構(gòu)倒千里光裂堿（產(chǎn)生1個和參數(shù)），經(jīng)衍生化后由質(zhì)譜分析，此時產(chǎn)生的單一信號（/155.095）可用內(nèi)標(biāo)定量，從而計算出樣品中總PAs含量。樣品中總PAs含量＝(天芥菜堿質(zhì)量×0.52×分析物衍生物的峰面積)/(草藥質(zhì)量×內(nèi)標(biāo)衍生物的峰面積)，其中分析物衍生物和內(nèi)標(biāo)衍生物分別指di-TMS-倒千里光裂堿和di-TMS-天芥菜定；0.52指倒千里光裂堿的轉(zhuǎn)換因子，由于倒千里光裂堿的相對分子質(zhì)量為155，而大多數(shù)以倒千里光裂堿為核心結(jié)構(gòu)的天然PAs和PANOs的相對分子質(zhì)量在299（石松胺）～413（藍(lán)薊定氮氧化物），因此在計算草藥樣品中PAs含量時，采用了一種保守的方法，選擇了相對分子質(zhì)量相對較小的石松胺與倒千里光裂堿的比值來將倒千里光裂堿的含量轉(zhuǎn)換為總PAs含量。

求和參數(shù)法的優(yōu)點在于漏檢率低，在無需所有對照品的情況下就能更準(zhǔn)確地反映出被分析產(chǎn)品的污染程度。近10年來，研究人員一直在嘗試改進(jìn)其前處理方法[60,62]，Kowalczyk等[60]使用七氟丁酸酐（heptafluorobutyric anhydride，HFBA）進(jìn)行衍生，70 ℃下30 min即可完成反應(yīng)。

（2）LC-MS聯(lián)用技術(shù)：LC-MS聯(lián)用技術(shù)由于其靈敏度、穩(wěn)定性和線性范圍方面的優(yōu)勢，廣泛用于PAs的定量分析。它能在一次分析運行中測定PAs的游離堿及其氧化物，且無需預(yù)還原PANOs；也可以避免熱不穩(wěn)定化合物（如氮氧化物或二酯化生物堿）的分解；由于吡咯環(huán)部分的氮原子容易電離，基于LC-MS的方法非常靈敏。在液相分離部分，常用C18、C8色譜柱和含有甲酸的水-乙腈作為流動相[36,63]。在離子化接口部分，目前電噴霧電離占主導(dǎo)地位，且?guī)缀踔皇褂谜x子模式。隨著技術(shù)的進(jìn)步，目前報道的可同時定量的PAs種類也越來越多[35]。Chen等[20]利用該技術(shù)建立了一種適用于茵陳蒿中PAs測定和風(fēng)險評估的UPLC-MS/MS方法，使用了34種對照品，定量限（limit of quantitation，LOQ）在0.1～0.5 μg/kg。Dzuman等[32]開發(fā)了一種靈敏的UPLC-MS/MS方法，用于檢測幾種常見污染基質(zhì)（牛至、涼茶等）中的33種PAs/PANOs，LOQ在0.5～10 μg/kg，且方法的回收率良好?？紤]到含PAs基質(zhì)的復(fù)雜性、多樣性，針對常見中藥基質(zhì)，整理并總結(jié)了PAs/PANOs的主要LC-MS條件以供參考（表2）。

A-關(guān)鍵步驟 B-分析過程中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)

表2 常見基質(zhì)中PAs/PANOs的主要LC-MS分析條件

PAs定量分析的1個主要缺點仍然是缺乏商業(yè)上可用的對照品，因此常用單個可用PA生成校準(zhǔn)曲線做相對定量。但由于PAs直接離子化效率的差異，其響應(yīng)可能會非常不同，這種對照品的缺乏也導(dǎo)致了許多方法沒有或不能得到適當(dāng)?shù)尿炞C。鑒于上述問題，Cramer等[1]在GC-MS求和參數(shù)法的基礎(chǔ)上，建立了LC-MS求和參數(shù)分析策略。改變了LiAlH4的用量來同時還原PANOs含有單/雙酯結(jié)構(gòu)的PAs生成其核心結(jié)構(gòu)（省去在酸性溶液中使用鋅粉還原的步驟），以同位素標(biāo)記的7--9--二丁酰[9,9-2H2]-倒千里光裂堿作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，最終使樣品制備和衍生化的時間減少了30%；無需所有對照品，對核心結(jié)構(gòu)總量進(jìn)行準(zhǔn)確定量；漏檢率低，更準(zhǔn)確地反映出被分析產(chǎn)品的污染總程度，這在監(jiān)管方法中極具借鑒價值。

4 PAs的限量標(biāo)準(zhǔn)與安全性控制現(xiàn)狀

由于PAs在自然界的廣泛存在和中草藥消費量的增加，含PAs藥品和食品的安全性已成為國內(nèi)外藥品監(jiān)管部門、相關(guān)機(jī)構(gòu)共同關(guān)心的國際性議題。表3總結(jié)了截至目前已報道的13種可誘發(fā)大鼠肝臟腫瘤的PAs和PANOs。其中毛果天芥菜堿、野百合堿、倒千里光堿、riddelliine已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)劃分在2B組（可能的人類致癌物）[66]。針對PAs在天然藥物和食品中存在的危害，許多國家和機(jī)構(gòu)制訂了相應(yīng)的法規(guī)，對其用藥范圍和用量做出了限制，因此，從PAs的肝毒性風(fēng)險（即非致癌性影響）和致癌性風(fēng)險評估方面進(jìn)行了整理，見表4。其中，對于PAs的肝毒性，主要采用無可見有害作用水平（no-observed-adverse-effect level，NOAEL）進(jìn)行風(fēng)險評估；對其致癌性風(fēng)險，則采用了暴露邊際（margin of exposure，MoE）方法進(jìn)行評估。

表3 可誘發(fā)大鼠肝臟腫瘤的PAs和PANOs

目前我國在這方面的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)等較為少見，尚未對PAs的攝入量作出明確規(guī)定，僅《中國藥典》2020年版“千里光”項中對阿多尼弗林堿的含量作出了規(guī)定，要求不得超過0.004%（即每克藥材中含量≤40 μg）[83]。然而一些普查類研究[18]，對藥典中386種藥材的32種PAs成分篩查發(fā)現(xiàn)，檢出PAs量折算藥典規(guī)定用量，超出上述限值的藥材有18種，其中紫草、款冬花、佩蘭、野馬追、千里光5個品種超標(biāo)倍數(shù)在10倍以上。以紫草為例，檢出PAs總量為25.57 μg/g，藥典規(guī)定用量5～10 g折算出攝入量在127.85～255.70 μg；遠(yuǎn)高于PAs致癌性風(fēng)險評估數(shù)據(jù)中60 kg體質(zhì)量成人的最大允許攝入量為0.42 μg/d。這對我國相關(guān)藥材及其制劑中PAs的檢測、安全限量標(biāo)準(zhǔn)制定以及監(jiān)管提出了緊迫的需求。

值得注意的是，PAs種類較多，其毒性大小不同，如果僅以簡單的總量予以控制，未必適用于所有種類的中草藥。而且由于目前尚缺乏更多的臨床數(shù)據(jù)和統(tǒng)計學(xué)結(jié)果，故很難確定其最終限度。此外，并非所有PAs都有毒性，一些PAs已顯示出了各種各樣的藥理活性[84]。在探討含PAs中藥的用藥安全時，還需考慮中藥用藥的特殊性及中藥成分的復(fù)雜性，不可忽視中醫(yī)藥在長期臨床應(yīng)用和實踐中積累的真實世界數(shù)據(jù)和大量減毒或控毒增效方法。如上述提到的含HPAs的紫苑和款冬，張建偉等[85]通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，兩者配伍后急性毒性降低，款冬能明顯降低紫菀的肝損傷作用。同時，中草藥中PAs的含量根據(jù)產(chǎn)地、采收、儲藏、炮制情況也各有不同。對于PAs安全限量標(biāo)準(zhǔn)的制定，關(guān)鍵在于對其化學(xué)性質(zhì)、毒理、藥理、基原植物和臨床實際用藥情況的系統(tǒng)認(rèn)識，才能真正保障用藥的安全性。

表4 不同國家/機(jī)構(gòu)對于PAs的限量標(biāo)準(zhǔn)

5 結(jié)語

中藥的用藥安全性一直是中醫(yī)藥傳承和發(fā)展的重要基礎(chǔ)和前提。近年來，隨著分析技術(shù)手段的進(jìn)步，越來越多潛在的高風(fēng)險毒性成分被發(fā)現(xiàn)、并逐漸明晰其毒性作用機(jī)制。由于含PAs的植物在自然界分布極廣、種類極多，且部分成分已被明確報道具有肝毒性和致癌性[86]，對這類中藥中潛在的毒性成分進(jìn)行分析和研究尤為重要。

PAs紫外吸收差，HPLC法無法用于微量/痕量級別的定性定量分析，GC-MS和LC-MSn以其靈敏、專屬和穩(wěn)定的分析方法，近年來迅速發(fā)展并應(yīng)用于大量的質(zhì)量控制和毒理學(xué)研究中。其中面臨的最主要問題是毒性PAs種類繁多，缺乏足夠的商用對照品（尤其沒有PANOs的商業(yè)來源）。目前最主流的研究手段集中于通過定量單個PA，獲得量化后PA的加和值，最多的同時檢測PAs數(shù)量已近50種。但基于單一PA測定的量化值，取決于使用PA/ PANO對照品種類的多少，存在高成本以及不可忽視的漏檢風(fēng)險?；谔卣髟\斷碎片離子的篩查策略，以及基于還原成母核結(jié)構(gòu)并衍生后檢測的“總和參數(shù)”策略可以滿足無對照品情況下的高通量篩查以及高度簡化的1,2-不飽和PAs的總和量化。

本文綜述了對現(xiàn)有藥典品種的測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)部分藥典收錄的中藥中檢出HPAs，這其中還包括了一些常用品種。此外，其他非藥典品種，包括地方標(biāo)準(zhǔn)品種、民間習(xí)用品、藥食同源品種、膳食補充劑和茶飲中均有報道，長期攝入對公眾健康有著不可忽視的風(fēng)險。

目前，有關(guān)PAs類毒性成分的研究己具備一定基礎(chǔ)。有關(guān)PAs類成分的攝入標(biāo)準(zhǔn)，多個國家與機(jī)構(gòu)已設(shè)置了明確的限量標(biāo)準(zhǔn)與使用規(guī)定；而我國除了個別品種外，現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)與法規(guī)尚缺乏相應(yīng)的參照和系統(tǒng)的檢測要求。此現(xiàn)狀應(yīng)當(dāng)引起有關(guān)部門的重視：開展更廣泛的調(diào)查與研究，追溯所有可能含有PAs的基原物種；根據(jù)毒性PAs/PANOs在不同來源藥材中的分布情況，建立高效快速的檢測方法，進(jìn)行系統(tǒng)性的質(zhì)量評價；對潛在含毒性PAs產(chǎn)品，結(jié)合臨床前及臨床數(shù)據(jù)，制定出科學(xué)合理的限量標(biāo)準(zhǔn)；在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，加強(qiáng)中藥復(fù)方配伍規(guī)律的研究，以達(dá)到減毒增效的作用；建立相應(yīng)的法規(guī)和監(jiān)控體系，以保證傳統(tǒng)常用中藥材的用藥安全。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Toxic pyrrolizidine alkaloids in Chinese herbal medicine: Control status and advances in analytical method

MA Yue-xin1, 2, FENG You-long2, WU Yan-yan2, ZHOU Juan-juan2, ZHANG Ying1, 2, YANG Jing1, 2, CAO Ling2, HUANG Qing2

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210019, China

Pyrrolizidine alkaloids (PAs) is a kind of widely distributed endogenous toxic components of plants with hepatotoxicity, genotoxicity and carcinogenicity. More than 660 PAs/PAs-oxide were identified so far, occurring in presumably 3% of all flowering plants. Chinese herbal medicines that may contain toxic PAs, especially the varieties included inof 2020 edition were reviewed in this article, basic structures and plant origin of PAs, and risk assessment and limit setting by national regulatory authorities, and recent advances in analytical methods were summarized. The difficulties in qualitative and quantitative analysis were also discussed, suggestions on monitoring of toxic PAs were put forward in order to provide warning and reference for study on detection of toxic PAs and the policy making of supervisory department.

pyrrolizidine alkaloids; Chinese herbal medicine; risk assessment; limit; analytical methods; safety control

R284.11

A

0253 - 2670(2021)24 - 7645 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.24.028

2021-04-28

江蘇省衛(wèi)健委科研項目（LGY201810）；江蘇省衛(wèi)健委科研項目（LGY2019094）；江蘇省藥監(jiān)局科研項目（20170201）

馬躍新（1997—），男，碩士研究生，研究方向為中藥檢驗與分析。E-mail: mayuexin1997@hotmail.com

曹 玲（1971—），女，主任藥師，博士，主要從事藥品的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: clidc@sina.com

黃 青（1983—），女，副主任藥師，博士，主要從事食品藥品中高風(fēng)險物質(zhì)檢測與安全性評價研究。E-mail: 67658869@qq.com

[責(zé)任編輯 崔艷麗]