高效液相色譜法測(cè)定藜麥中齊墩果酸的含量

田建文,王彩艷,王 芳*,趙子丹

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院,銀川 750002;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 枸杞產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,銀川 750002)

藜麥?zhǔn)寝伎妻紝俚囊荒晟荼局参颷1],含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)、氨基酸[2]、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3],被聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織認(rèn)定是唯一滿(mǎn)足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的單體植物,并正式推薦為最適宜人類(lèi)的“全營(yíng)養(yǎng)食物”[4]。而藜麥中含有的皂苷成分是抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)[5],通常以齊墩果酸、三萜類(lèi)皂苷、商陸酸等形式存在[6-7]。其中,齊墩果酸具有護(hù)肝解毒、抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫、降糖和利尿等生物活性功能[8-9]。

目前齊墩果酸的測(cè)定方法主要有紫外分光光度法[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]、薄層色譜掃描法[12]、香草醛高氯酸法等。藜麥的品種多樣,其提取液呈現(xiàn)不同顏色,采用紫外分光光度法測(cè)定時(shí),顏色干擾嚴(yán)重,導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀價(jià)格高,推廣有一定局限性;薄層色譜掃描法顯色斑點(diǎn)不清晰,難以得到滿(mǎn)意的結(jié)果;香草醛高氯酸法測(cè)定過(guò)程復(fù)雜,分析效率較低,使用的高氯酸和乙酸具有強(qiáng)腐蝕性。因此,需要建立一種靈敏度高、準(zhǔn)確度高的簡(jiǎn)單高效分析方法。本工作通過(guò)優(yōu)化齊墩果酸的提取方法和色譜條件等,建立了高效液相色譜法測(cè)定藜麥中齊墩果酸含量的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AD 型高效液相色譜系統(tǒng),配紫外檢測(cè)器和Lab Solutions色譜工作站;PL202-S 型電子天平;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器;XMTD-4000型電熱恒溫水浴鍋。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.000 g·L－1,稱(chēng)取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.00001 g),用10 mL甲醇溶解,配制成質(zhì)量濃度為1.000 g·L－1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于－18 ℃保存。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:移取適量的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用甲醇逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度為5,10,20,100,200,500 mg·L－1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,于－18 ℃保存。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于98%;藜麥樣品采自寧夏固原地區(qū);鹽酸、乙酸銨、乙醇均為分析純;甲醇為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Agilent TC-C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);柱溫35℃;流量1.0 mL·min－1;進(jìn)樣量10μL;流動(dòng)相為體積比85∶15 的甲醇-0.1 mol·L－1乙酸銨溶液的混合液;等度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

對(duì)藜麥樣品進(jìn)行脫殼處理,稱(chēng)取藜麥1.5 g于150 mL磨口錐形瓶中,加入甲醇40 mL和3 mol·L－1鹽酸溶液10 mL,超聲提取20 min,再回流水解1.5 h,所得提取液按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)選用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%(體積分?jǐn)?shù))乙酸溶液的混合液、乙腈-含0.5%(體積分?jǐn)?shù))乙酸銨的甲醇溶液的混合液、甲醇-0.1 mol·L－1乙酸銨溶液的混合液5 種不同流動(dòng)相體系,以Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)為色譜柱時(shí),經(jīng)高效液相色譜分析,均可有效分離目標(biāo)成分齊墩果酸。結(jié)合出峰時(shí)間、峰形、雜質(zhì)的干擾等因素,試驗(yàn)最終選擇甲醇-0.1 mol·L－1乙酸銨溶液混合液為流動(dòng)相,并考察了甲醇和0.1 mol·L－1乙酸銨溶液的體積比分別為85∶15,90∶10,88∶12,80∶20時(shí)對(duì)齊墩果酸分離效果的影響。經(jīng)對(duì)比分析,以體積比為85∶15的甲醇-0.1 mol·L－1乙酸銨溶液的混合液為流動(dòng)相時(shí),齊墩果酸分離效果較好。

2.2 提取方式的選擇

齊墩果酸常用的提取方式有溶劑提取、超聲輔助提取、微波輔助提取[13]。根據(jù)齊墩果酸可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和三氯甲烷等有機(jī)溶劑,不溶于水的特性[14],試驗(yàn)考察了超聲、勻漿、振蕩3種提取方式對(duì)齊墩果酸測(cè)定值的影響。結(jié)果表明,經(jīng)上述3種方式提取后,雜質(zhì)干擾嚴(yán)重,齊墩果酸不能很好地分離,進(jìn)而影響其測(cè)定結(jié)果,無(wú)法得到準(zhǔn)確的測(cè)定值。齊墩果酸通常以游離酸的形式存在,經(jīng)水解可將其轉(zhuǎn)化成苷元以排除雜質(zhì)干擾,故考慮采用酸水解的方式提取齊墩果酸。

以甲醇-3 mol·L－1鹽酸溶液的混合液為提取劑,考察了直接酸水解(直接酸水解1.5 h)和超聲-酸水解(先超聲提取20 min,再回流水解1.5 h)兩種提取方式對(duì)齊墩果酸測(cè)定值的影響。結(jié)果表明,經(jīng)上述兩種方式提取后,齊墩果酸的測(cè)定值依次為2.54,2.99 g·kg－1;樣品經(jīng)超聲-酸水解后,能有效排除雜質(zhì)的干擾,同時(shí)對(duì)該提取方式進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),驗(yàn)證方法的可行性,回收率為99.2%。因此,試驗(yàn)選擇超聲-酸水解的方式來(lái)提取藜麥中的齊墩果酸。

2.3 提取劑的選擇

試驗(yàn)采用超聲-酸水解的提取方式,進(jìn)一步考察了甲醇-鹽酸溶液的混合液、乙醇-鹽酸溶液的混合液兩種提取劑對(duì)齊墩果酸測(cè)定值的影響。結(jié)果表明,經(jīng)甲醇-鹽酸溶液的混合液提取后,藜麥樣品提取液中雜質(zhì)少,齊墩果酸分離效果好,測(cè)定值為2.99 g·kg－1,提取率高;而經(jīng)乙醇-鹽酸混合液提取后,齊墩果酸的測(cè)定值在2.75 g·kg－1左右,提取率較低。因此,試驗(yàn)選擇提取劑為甲醇-鹽酸溶液的混合液。

2.4 正交試驗(yàn)

采用L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化水解條件,考察了水解時(shí)間(A)、鹽酸濃度(B)、甲醇體積分?jǐn)?shù)(C)3個(gè)因素對(duì)齊墩果酸測(cè)定值的影響,每個(gè)因素選取3個(gè)水平,并添加空列來(lái)衡量試驗(yàn)的可靠程度,結(jié)果見(jiàn)表1,并對(duì)優(yōu)化出的組合進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of orthogonal test

表1 (續(xù))

結(jié)果表明,空列的極差較小,說(shuō)明試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理。甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)齊墩果酸測(cè)定值的影響較大,其次是水解時(shí)間和鹽酸濃度,得出最優(yōu)試驗(yàn)組合為C3A1B2和C3A2B2。按試驗(yàn)方法對(duì)兩種組合進(jìn)行驗(yàn)證,所得齊墩果酸的測(cè)定值分別為1.38,1.61 g·kg－1,可知當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%,鹽酸濃度為3 mol·L－1,水解時(shí)間為1.5 h時(shí),藜麥中齊墩果酸的測(cè)定值相對(duì)較高。綜上分析,試驗(yàn)選擇以含3 mol·L－1鹽酸的80%甲醇溶液為提取劑,采用超聲-酸水解1.5 h的方式提取藜麥中的齊墩果酸。對(duì)優(yōu)化出的試驗(yàn)組合進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),所得平均回收率為98.6%。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與檢出限

按照試驗(yàn)方法對(duì)齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以齊墩果酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明,齊墩果酸的質(zhì)量濃度在5～500 mg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線(xiàn)性關(guān)系,線(xiàn)性回歸方程為y＝1.732×106x－6.272×103,相關(guān)系數(shù)為0.9994。

對(duì)0.02 mg·L－1齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,以3倍信噪比(S/N)作為檢出限(3S/N),10倍信噪比作為測(cè)定下限(10S/N),計(jì)算得齊墩果酸的檢出限為0.3 mg·kg－1,測(cè)定下限為1.0 mg·kg－1。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法,對(duì)放置0,2,4,6,8,12,24 h的藜麥樣品提取液進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算齊墩果酸保留時(shí)間及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明,齊墩果酸保留時(shí)間的RSD 為0.23%,峰面積的RSD 為3.9%,說(shuō)明藜麥樣品提取液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法,對(duì)藜麥樣品進(jìn)行低(50 mg·L－1)、中(100 mg·L－1)、高(200 mg·L－1)等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),計(jì)算回收率和測(cè)定值的RSD,以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和精密度,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

結(jié)果顯示,齊墩果酸的回收率為98.0%～101%,RSD 為4.2%～7.5%,表明該方法的準(zhǔn)確度高、精密度好,滿(mǎn)足分析要求。

2.8 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)12個(gè)藜麥樣品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示,12個(gè)藜麥樣品中均檢出齊墩果酸,檢出量依次 為9.63,21.26,3.79,0.68,1.47,1.45,1.80,0.73,0.51,1.66,5.31,0.67 g·kg－1。

本工作以超聲-酸水解的方式提取樣品,建立了高效液相色譜法測(cè)定藜麥中齊墩果酸含量的方法。該方法簡(jiǎn)單、快速,重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好,避免了分光光度法顏色干擾問(wèn)題及強(qiáng)腐蝕試劑的使用,提高了分析的準(zhǔn)確性。