蘿卜硫素對心肌缺血再灌注損傷大鼠IRE-1/XBP-1通路及心肌凋亡的影響

王帥，邢彩耐，鄔鵬宇，崔志成，趙長全

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）屬臨床常見癥狀，隨著人民生活方式改變，發(fā)病率逐漸升高，且呈年輕化趨勢，危害生命健康[1]。再灌注改善心肌供血的同時可產(chǎn)生一系列病理現(xiàn)象，包括過氧化反應(yīng)及炎癥反應(yīng)等，出現(xiàn)不可逆的細(xì)胞凋亡和壞死[2]，因此細(xì)胞凋亡可反映MIBI疾病損傷情況，減少細(xì)胞損傷對于緩解疾病具有重要意義。蘿卜硫素（SFN）是一種異硫氰酸酯類家族藥物，具有抗氧化活性、抗腫瘤等功效，近年研究發(fā)現(xiàn)其在心肌細(xì)胞中具有抑制心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激作用，從而緩解心肌損傷[3]，但具體機(jī)制尚不明確。肌醇需求酶1（IRE-1）/X-盒結(jié)合蛋白-1（XBP-1）通路調(diào)控多種炎癥因子表達(dá)，同時影響細(xì)胞凋亡，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上重要通路[4]，推測SFN影響IRE-1/XBP-1通路實現(xiàn)對心肌細(xì)胞凋亡的影響。因此，SFN、IRE-1特異性抑制劑STF-083010預(yù)處理大鼠后，建立MIRI模型，初步探究SFN影響MIRI心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Wistar雄性大鼠50只，南京君科生物有限公司提供，合格證號：SCXK（蘇）2019-0021，體質(zhì)量220～240 g，SPF級。所有大鼠均在20～25℃，濕度40%～60%，12 h自然光照，自由飲水?dāng)z食條件下暫養(yǎng)，7 d后用于實驗研究。本實驗經(jīng)本院倫理會審核并通過。

1.2 試劑與儀器SFN（上海原葉生物有限公司，批號：121-42-3）；IRE-1特異性抑制劑STF-083010（美國Selleck公司，CAS號：307543-71-1）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光）（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：C0105、C1086）；2×Hi SYBR Green QPCR Mix（日本TaKaRa公司，貨號：ARR041A）；一抗兔抗IRE-1、p-IRE-1、XBP-1、β-actin（英國abcam公司，貨號：ab37073、ab48187、ab37152、ab8226）。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase3）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（BCL2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（BAX）、β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（賽默飛世爾，型號：StepOnePlus Real-Time PCR system）。

1.3 研究方法

1.3.1 實驗分組及造模實驗分為假手術(shù)組、模型組、SFN組、STF-083010組、SFN+STF-083010組共五組，每組10只。實驗前STF-083010經(jīng)DMSO溶解后生理鹽水稀釋至3 g/L。冠狀動脈左室支結(jié)扎前2 h，SFN組尾靜脈注射5 mg/kg SFN[5]，STF-083010組腹腔注射30 mg/kg STF-083010[6]，SFN+STF-083010組在SFN組基礎(chǔ)上腹腔注射30 mg/kg STF-083010，假手術(shù)組、模型組尾靜脈和腹腔注射等體積生理鹽水。

除假手術(shù)組外參考文獻(xiàn)[7]建立MIRI模型，40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，氣管插管，小動物呼吸機(jī)機(jī)械通氣。剖開腹腔暴露出心臟，分離右側(cè)頸總動脈，心導(dǎo)管經(jīng)右側(cè)頸動脈插入左心室。胸骨左緣2～3 mm處切口，第4肋間夾閉肋間血管暴露左心耳及左心室。左心耳下緣2 mm以無創(chuàng)小圓針帶6-0絲線進(jìn)針穿過冠狀動脈左降支下方心肌表層，縫線兩端引出硅膠套管（硅膠套管一端緊貼左心室壁），收緊結(jié)扎線持續(xù)缺血30 min；松開結(jié)扎線再灌注2 h。模型建立成功的標(biāo)志：收緊結(jié)扎線30 min時出現(xiàn)心肌組織發(fā)紺或蒼白，心電圖檢測ST段抬高現(xiàn)象；再灌注后心臟缺血區(qū)域變紅，ST段降低超過50%。假手術(shù)組僅打開胸腔暴露出心臟穿絲線而不結(jié)扎。

1.3.2 TTC染色檢測心肌梗死情況待大鼠自主呼吸，將大鼠置于籠中，次日清晨處死大鼠，每組大鼠隨機(jī)4只迅速摘除心臟，平行心室橫切成5片，1%TTC磷酸緩沖液中37℃孵育20 min，10%甲醛室溫固定1 h。拍照觀察，正常心肌呈紅色，梗死區(qū)呈白色。Image-J軟件分析梗死體積，梗死體積百分比=白色區(qū)體積/心肌組織體積×100%。

1.3.3 HE染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)情況每組剩余6只大鼠迅速摘除心臟，部分置于4%多聚甲醛中固定，固定后切片；部分置于-80℃冰箱中保存待用。部分切片嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行染色，中性樹膠封片，顯微鏡拍照觀察。

1.3.4 TUNEL染色觀察心肌組織細(xì)胞凋亡情況部分切片按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書對心肌組織凋亡細(xì)胞染色，DAPI染色細(xì)胞核。采用熒光顯微鏡觀察組織染色情況，利用Image-J軟件評定陽性染色細(xì)胞數(shù)量百分比，則細(xì)胞凋亡率=陽性染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.5 qRT-PCR檢測心肌組織中caspase3、BCL2、BAX mRNA表達(dá)取部分心肌組織，TRIZOL法提取總RNA，cDNA合成試劑盒合成cDNA，qRT-PCR儀檢測心肌組織中caspase3、BCL2、BAX mRNA水平。引物序列caspase3 F：5’-GCAGCAGCCTCAAATTGTTGAC-3’、R：5’-TGCTCCGGCTCAAACCATC-3’，BCL2 F：5’-CCTTTGTGTAACTGTACGGCC-3’、R：5’-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTCGAC-3’，BAX F：5’-GGATGCGTCCACCAAGAA-3’、R：5’-TCCCGGAGGAAGTCCATT-3’，β-actin F：5’-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3’、R：5’-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3’。qRT-PCR儀擴(kuò)增，上樣體系：2×Mix 1 μl、F/R（10 μM）各0.5 μl、ddH2O 8.0 μl。擴(kuò)增程序：95℃，5 min；94℃、20 s，61℃、65 s，40個循環(huán)，采用2-△△CT法計算caspase3、BCL2、BAX mRNA相對表達(dá)量。

1.3.6 免疫印跡法檢測心肌組織中IRE-1、p-IRE-1、XBP-1蛋白表達(dá)取部分心肌組織，RIPA裂解液冰上研磨組織并裂解20 min，4℃離心機(jī)10 000g離心20 min，收集上清為總蛋白，上樣20 ng行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后一抗IRE-1、p-IRE-1、XBP-1、β-actin 4℃孵育過夜，加入對應(yīng)二抗，ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，Image-J軟件定量掃描蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達(dá)水平=待測蛋白灰度值/相對蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFN對大鼠心肌梗死的影響與假手術(shù)組相比，模型組心肌梗死體積百分比升高（P＜0.05）；與模型組比較，SFN組、STF-083010組、SFN+STF-083010組心肌梗死體積百分比降低（P＜0.05）；分別與SFN組、STF-083010組比較，SFN+STF-083010組心肌梗死體積百分比降低（P＜0.05），見圖1及表1。

表1 5組大鼠心肌梗死體積百分比的比較（n=4）

圖1 5組大鼠心肌梗死情況

2.2 SFN對大鼠心肌組織形態(tài)的影響假手術(shù)組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，整齊，細(xì)胞無破損等現(xiàn)象；模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞膜破壞嚴(yán)重，細(xì)胞核部分散落在外；SFN組心肌細(xì)胞排列紊亂部分緩解，見少量細(xì)胞核散落；STF-083010組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核散落嚴(yán)重；SFN+STF-083010組細(xì)胞排列恢復(fù)正常，排列整齊（圖2）。

圖2 5組大鼠心肌組織形態(tài)情況（400×）

2.3 SFN對大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡的影響與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，SFN組、STF-083010組、SFN+STF-083010組心肌組織細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；分別與SFN組、STF-083010組比較，SFN+STF-083010組心肌組織細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），表2。

表2 5組心肌組織細(xì)胞凋亡率比較（n=6）

2.4 SFN對大鼠心肌組織中caspase3、BCL2、BAX mRNA水平的影響與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織中caspase3、BAX mRNA水平升高，BCL2 mRNA水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，SFN組、STF-083010組、SFN+STF-083010組心肌組織中caspase3、BAX mRNA水平降低，BCL2 mRNA水平升高（P＜0.05）；與SFN組比較，SFN+STF-083010組心肌組織中BAX mRNA水平降低，與STF-083010組比較，SFN+STF-083010組心肌組織中caspase3、BAX mRNA水平降低，BCL2 mRNA水平升高（P＜0.05），表3。

表3 5組心肌組織中caspase3、BCL2、BAX mRNA水平比較（n=6）

2.5 SFN對大鼠心肌組織中IRE-1、p-IRE-1、XBP-1蛋白的影響5組心肌組織中IRE-1蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織中p-IRE-1/IRE-1、XBP-1蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，SFN組、STF-083010組、SFN+STF-083010組心肌組織中p-IRE-1/IRE-1、XBP-1蛋白水平降低（P＜0.05）；分別與SFN組、STF-083010組比較，SFN+STF-083010組心肌組織中p-IRE-1/IRE-1、XBP-1蛋白水平降低（P＜0.05）見圖3及表4。

圖3 5組心肌組織中IRE-1、p-IRE-1、XBP-1蛋白水平

表4 5組心肌組織中IRE-1、p-IRE-1、XBP-1蛋白水平比較（n=6）

3 討論

MIRI造成的心肌細(xì)胞凋亡是心肌損傷的最終末發(fā)病環(huán)節(jié)，是導(dǎo)致心肌纖維化、心律失常、心室重構(gòu)、心衰的重要因素，因此，衡量MIRI關(guān)鍵在于心肌細(xì)胞凋亡情況是否緩解[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組腦梗死體積比例升高，心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞膜破壞嚴(yán)重，細(xì)胞核部分散落在外，心肌細(xì)胞凋亡率升高，提示MIRI造成心肌組織出現(xiàn)病變，心肌細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞核暴露在外，心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重，凋亡嚴(yán)重。SFN作為存在于十字花科植物中天然抗氧化劑，是迄今發(fā)現(xiàn)的抗氧化能力較強(qiáng)的物質(zhì)之一，可調(diào)控多種氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)對機(jī)體的保護(hù)，在MIRI中可改善心室功能、減少心肌梗死體積、減少心肌細(xì)胞凋亡[9]。與模型組比較，SFN組腦梗死體積比例降低，心肌細(xì)胞排列紊亂部分緩解，見少量細(xì)胞核散落，細(xì)胞凋亡率降低，提示SFN可緩解心肌細(xì)胞破壞嚴(yán)重現(xiàn)象，減少細(xì)胞凋亡，實現(xiàn)對心肌細(xì)胞的保護(hù)。

細(xì)胞凋亡經(jīng)典途徑主要有三條：死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[10]，但最終都激活凋亡執(zhí)行蛋白caspase3促進(jìn)細(xì)胞凋亡，caspase3水平反映細(xì)胞凋亡情況[11]；抑制caspase3的表達(dá)可減輕MIRI心肌細(xì)胞凋亡狀況，減少心肌組織損傷、降低心肌梗死體積，實現(xiàn)對心肌組織的保護(hù)[12,13]。BCL2家族蛋白在細(xì)胞凋亡過程中起重要的調(diào)控作用，BCL2抗凋亡、BAX促凋亡，BAX結(jié)合BCL2，拮抗BCL2促凋亡，相互協(xié)調(diào)，激活下游基因發(fā)揮作用[14]。BAX水平升高時會形成大量的BAX同源二聚體，誘導(dǎo)Cyt-C釋放至細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)一系列反應(yīng)酶切caspase3酶原，激活caspase3活化，啟動caspase3級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織中caspase3、BAX mRNA水平升高，BCL2 mRNA水平降低，提示心肌組織中心肌細(xì)胞破壞損傷刺激BAX水平升高，BAX形成大量的同源二聚體通過一系列反應(yīng)刺激caspase3活化，啟動caspase3級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，加重疾病進(jìn)程。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞凋亡的一個主要途徑，負(fù)責(zé)蛋白合成、折疊、組裝的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在外部刺激下錯誤折疊、組裝，導(dǎo)致蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上聚集而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不能通過自我調(diào)節(jié)而恢復(fù)其功能時就會誘發(fā)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞程序性死亡[16]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要通過PERK/eIF2α通路、IRE-1/XBP-1通路、ATF6通路介導(dǎo)反應(yīng)，其中IRE-1是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的核心調(diào)控因子，活化IRE-1后可誘導(dǎo)損傷[17]；XBP-1是IRE-1下游應(yīng)激相關(guān)因子，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)構(gòu)造相關(guān)，IRE-1剪接作用下XBP-1 mRNA特異位點減去一個26bp長度的內(nèi)含子，改變XBP-1閱讀框，轉(zhuǎn)錄成有活性的XBP-1發(fā)揮作用[18]，XBP-1激活如CHOP、GRP78等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)從而下調(diào)BCL2水平，發(fā)揮凋亡作用[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織中p-IRE-1/IRE-1、XBP-1蛋白水平升高，提示心肌損傷導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，IRE-1活化促進(jìn)XBP-1閱讀框改變而轉(zhuǎn)錄成有活性的XBP-1，激活下游轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)BCL2、上調(diào)BAX，激活caspase3活化，啟動級聯(lián)反應(yīng)從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，加重MIRI。與模型組相比，SFN組、STF-083010組、SFN+STF-083010組心肌組織中p-IRE-1/IRE-1、XBP-1蛋白水平降低；分別與SFN組、STF-083010組相比，SFN+STF-083010組心肌組織中p-IRE-1/IRE-1、XBP-1蛋白水平降低。提示SFN與STF-083010功能類似，可抑制IRE-1活化，從而使活性XBP-1水平降低，XBP-1減弱對下游轉(zhuǎn)錄因子的影響，轉(zhuǎn)錄因子對BCL2、BAX作用減弱，caspase3活性降低，從而降低心肌細(xì)胞凋亡，實現(xiàn)對MIRI的保護(hù)。

綜上所述，SFN與IRE-1抑制劑作用類似，均可抑制心肌細(xì)胞凋亡，實現(xiàn)對MIRI的保護(hù)，因此SFN可能通過抑制IRE-1/XBP-1通路發(fā)揮作用。但XBP-1下游轉(zhuǎn)錄因子較多，通過具體轉(zhuǎn)錄因子對BCL2、BAX的影響是本文進(jìn)一步研究重點。