益心泰醇提物對(duì)阿霉素致慢性心力衰竭兔TGF-β1/Smad3信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響

雷洋，羅莉，郭志華，魏佳明，劉承鑫，龍?jiān)疲圃?/p>

益心泰醇提物對(duì)阿霉素致慢性心力衰竭兔TGF-β1/Smad3信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響

雷洋1，羅莉2，郭志華2，魏佳明2，劉承鑫2，龍?jiān)?，唐云3

1.湖南省中醫(yī)藥研究院文獻(xiàn)信息研究所，湖南 長沙 410006；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

觀察益心泰醇提物對(duì)阿霉素致慢性心力衰竭（CHF）兔TGF-β1/Smad3信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。采用阿霉素耳緣靜脈注射建立CHF兔模型，將成模兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、氯沙坦鉀組（2.73 mg/kg）及益心泰醇提物低、中、高劑量組（1.77、3.54、7.08 g/kg），分別給予相應(yīng)藥物灌胃，模型組和對(duì)照組予等體積蒸餾水灌胃，1次/d，連續(xù)4周。超聲心動(dòng)儀檢測(cè)兔左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）；ELISA檢測(cè)兔血清N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）含量；TUNEL染色法檢測(cè)兔心肌細(xì)胞凋亡率；Western blot檢測(cè)兔心肌組織Bax、Bcl-2、轉(zhuǎn)化生子因子β1（TGF-β1）、Smad3、Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）、Ⅲ型膠原（CollagenⅢ）蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，模型組兔LVEF明顯降低（＜0.01），血清NT-proBNP、AngⅡ含量明顯增加（＜0.01），心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高（＜0.01），心肌組織Bax、TGF-β1、Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，益心泰醇提物各劑量組兔LVEF明顯升高（＜0.05），血清NT-proBNP、AngⅡ含量明顯減少（＜0.05，＜0.01），心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低（＜0.05，＜0.01），心肌組織Bax、TGF-β1、Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，其中益心泰醇提物高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。益心泰醇提物可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，改善兔心肌纖維化，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮治療CHF作用。

益心泰醇提物；慢性心力衰竭；心肌細(xì)胞凋亡；心肌纖維化；TGF-β1/Smad3；兔

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是各種心臟疾病發(fā)展至終末期的臨床綜合征，其患病率、病死率逐年升高，嚴(yán)重威脅人類健康。心肌細(xì)胞異常凋亡是CHF的發(fā)病機(jī)制之一，因細(xì)胞過度死亡，可使心臟功能下降，最終導(dǎo)致CHF[1]。TGF-β1/Smad3信號(hào)通路與CHF心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）密切相關(guān)，可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖、分化，刺激膠原纖維合成[2-3]。TGF-β1/Smad3信號(hào)通路除與MF密切相關(guān)外，還與細(xì)胞凋亡有關(guān)。Heger等[4]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β能促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞凋亡。Dubash等[5]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生CHF時(shí)，TGF-β1水平明顯升高，并可刺激心肌細(xì)胞凋亡。CHF屬中醫(yī)學(xué)“水腫”“胸痹”等范疇，為本虛標(biāo)實(shí)之證，本課題組根據(jù)其病機(jī)研制益氣活血利水方劑益心泰。前期研究表明，益心泰治療CHF可能與TGF-β信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡有關(guān)，且能明顯降低CHF兔心肌組織TGF-β蛋白表達(dá)[6]。本研究以阿霉素致CHF兔為模型[7]，觀察益心泰醇提物對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的影響，探討其治療CHF的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年新西蘭大白兔，120只，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)提供，動(dòng)物合格證號(hào)4308300000677，飼養(yǎng)于溫度18～25 ℃、相對(duì)濕度55%～70%環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批（LL2018010801）。

1.2 藥物及制備

益心泰由黃芪、丹參、紅花、澤瀉、豬苓按照3∶1.5∶1∶1∶1比例組成，飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，加熱回流提取2次，第一次加8倍量70%乙醇提取120 min，第二次加6倍量70%乙醇提取90 min，過濾，合并提取液，減壓濃縮，105 ℃真空干燥3 h，制成含原藥材3.67 g/g醇提物干粉，加蒸餾水溶解，配制成濃度分別為0.177、0.354、0.708 g/mL藥液。注射用鹽酸多柔比星（主要成分為鹽酸阿霉素），湖北麥凱斯精化科技有限責(zé)任公司，批號(hào)130509-201603，生理鹽水溶解，配制成濃度為1 mg/mL溶液。氯沙坦鉀片，杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)20171020，蒸餾水配制成0.273 mg/mL懸濁液。

1.3 主要試劑與儀器

N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP）ELISA檢測(cè)試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)ml027326；血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）ELISA檢測(cè)試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)ml027730；GAPDH抗體，上海振譽(yù)生物科技有限公司，貨號(hào)bs-075R-1；Bax抗體，美國CST，貨號(hào)2772；Bcl-2抗體，美國CST，貨號(hào)2762；TGF-β1抗體，英國Abcam，貨號(hào)ab92486；Smad3抗體，英國Abcam，貨號(hào)ab40854；CollagenⅠ抗體，上海博研生物科技有限公司，貨號(hào)BYK-0578R；CollagenⅢ抗體，上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)ys-7322R；羊抗兔二抗，美國Thermo Fisher，貨號(hào)G-21234；羊抗鼠二抗，美國Thermo Fisher，貨號(hào)G-21040；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒，德國Merck，貨號(hào)QIA33；抗熒光衰減封片劑（含DAPI），北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)S2110；SlowFadTMGold Antifade Mountant，美國Thermo Fisher，貨號(hào)S36936。Sequoia 512超聲心動(dòng)儀（德國西門子），MK3酶標(biāo)儀（美國Thermo），DYY-7C型電泳儀（北京市六一儀器廠），SYSTEM GelDoc XR＋凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad），iQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad）。

1.4 造模、分組及給藥

隨機(jī)選取20只兔作為對(duì)照組，其余100只為造模組，耳緣靜脈局部皮膚消毒后，注射阿霉素注射液（1 mg/kg），2次/d，連續(xù)8周。檢測(cè)兔左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及血清NT-proBNP含量。LVEF顯著降低（＜0.01）、血清NT-proBNP含量顯著增加（＜0.01），提示造模成功。將90只成模兔（10只因腹瀉死亡）隨機(jī)分為模型組、氯沙坦組和益心泰醇提物低、中、高劑量組，每組18只。根據(jù)成人體表面積換算法[8]，氯沙坦鉀組予2.73 mg/kg氯沙坦鉀懸濁液灌胃，益心泰醇提物低、中、高劑量組分別予1.77、3.54、7.08 g/kg益心泰藥液灌胃，灌胃體積10 mL/kg，模型組和對(duì)照組予等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)4周。給藥過程中，模型組兔死亡2只、益心泰醇提物低、中、高劑量組分別死亡1、2、1只，最終對(duì)照組、模型組、氯沙坦鉀組和益心泰醇提物低、中、高劑量組兔分別為20、16、18、17、16、17只。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 左室射血分?jǐn)?shù)

給藥結(jié)束后水合氯醛腹腔注射麻醉兔，進(jìn)行心臟觸診，確定心尖搏動(dòng)處，硫化鈉脫毛暴露心前區(qū)，超聲心動(dòng)儀檢測(cè)兔LVEF，測(cè)量3次，取平均值。

1.5.2 血清N末端B型利鈉肽原、血管緊張素Ⅱ含量

給藥結(jié)束后水合氯醛腹腔注射麻醉兔，腹主動(dòng)脈采血，ELISA檢測(cè)兔血清NT-proBNP、AngⅡ含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.3 心肌細(xì)胞凋亡率

給藥結(jié)束后水合氯醛腹腔注射麻醉兔，取心肌組織，常規(guī)固定，石蠟包埋，切片，TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。熒光顯微鏡下觀察并拍照，以細(xì)胞核被染成紅色（細(xì)胞凋亡）為陽性結(jié)果，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率（%）＝凋亡細(xì)胞核÷總細(xì)胞核×100%。

1.5.4 心肌組織Bax、Bcl-2、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、Smad3、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)

取心肌組織提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，等量蛋白上樣，60 V電泳至蛋白到達(dá)濃縮膠與分離膠分界處，將電壓調(diào)整為100 V，電泳至蛋白到達(dá)分離膠底部，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入稀釋的Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、TGF-β1（1∶1 000）、Smad3（1∶1 000）、CollagenⅠ（1∶1 000）、CollagenⅢ（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃孵育過夜；加二抗（1∶3 000）室溫孵育45 min，Quantity One圖像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各目的蛋白與GAPDH灰度值的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 益心泰醇提物對(duì)模型兔左室射血分?jǐn)?shù)的影響

與對(duì)照組比較，模型組兔LVEF顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，益心泰醇提物低、中、高劑量組和氯沙坦鉀組兔LVEF明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。見表1。

表1 各組兔LVEF比較（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，##＜0.01；與模型組比較，*＜0.05

2.2 益心泰醇提物對(duì)模型兔血清N末端B型利鈉肽原、血管緊張素Ⅱ含量的影響

與對(duì)照組比較，模型組兔血清NT-proBNP、AngⅡ含量明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，益心泰醇提物低、中、高劑量組和氯沙坦鉀組兔血清NT-proBNP、AngⅡ含量明顯減少（＜0.05，＜0.01）。見表2。

表2 各組兔血清NT-proBNP、AngⅡ含量比較（±s，pg/mL）

注：與對(duì)照組比較，##＜0.01；與模型組比較，*＜0.05，**＜0.01

2.3 益心泰醇提物對(duì)模型兔心肌細(xì)胞凋亡率的影響

與對(duì)照組比較，模型組兔心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，益心泰醇提物低、中、高劑量組和氯沙坦鉀組兔心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。見表3、圖1。

2.4 益心泰醇提物對(duì)模型兔心肌組織Bax、Bcl-2、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、Smad3、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組兔心肌組織Bax、TGF-β1、Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，益心泰醇提物低、中、高劑量組和氯沙坦鉀組兔心肌組織Bax、TGF-β1、Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，除益心泰醇提物低劑量組CollagenⅠ、CollagenⅢ和益心泰醇提物中劑量組CollagenⅢ外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。見表4、圖2。

表3 各組兔心肌細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，##＜0.01；與模型組比較，*＜0.05，**＜0.01

圖1 各組兔心肌細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)（TUNEL染色，×400）

表4 各組兔心肌組織Bax、Bcl-2、TGF-β1、Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，##＜0.01；與模型組比較，*＜0.05，**＜0.01

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.益心泰醇提物低劑量組；D.益心泰醇提物中劑量組；E.益心泰醇提物高劑量組；F.氯沙坦鉀組

3 討論

MF是CHF的主要病理機(jī)制，而TGF-β1/Smad3信號(hào)通路與MF密切相關(guān)。TGF-β有多種亞型，其中在心臟主要是TGF-β1亞型。TGF-β1是調(diào)控MF的關(guān)鍵細(xì)胞因子，在AngⅡ等刺激下，通過其下游信號(hào)分子Smad3進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，使MF的主要效應(yīng)細(xì)胞心肌成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，從而介導(dǎo)CollagenⅠ、CollagenⅢ等細(xì)胞外基質(zhì)合成增加[9]。AngⅡ通過作用于AngⅡ受體1（AT1）收縮血管、損傷內(nèi)皮功能，導(dǎo)致血管重構(gòu)而致MF，現(xiàn)已被用于誘導(dǎo)MF模型[10]。心肌膠原纖維蛋白主要由CollagenⅠ和CollagenⅢ組成，二者大量沉積可使纖維化疤痕形成，促使MF發(fā)生發(fā)展[11]。故AngⅡ、CollagenⅠ、CollagenⅢ是反映MF的重要指標(biāo)。氯沙坦鉀作為一種AT1受體拮抗劑，可通過調(diào)節(jié)心肌組織TGF-β1/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)揮抑制MF作用[12]。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體自身的防御機(jī)制，早期可清除體內(nèi)明顯受損的細(xì)胞，后期因細(xì)胞過度死亡，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。CHF的發(fā)生與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[13]，TGF-β1/Smads信號(hào)通路除與MF有關(guān)，還參與CHF心肌細(xì)胞凋亡。當(dāng)發(fā)生CHF時(shí)，TGF-β1/Smads信號(hào)通路激活，心肌細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白明顯升高[14]。AngⅡ不僅可激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，導(dǎo)致MF的發(fā)生發(fā)展，還可使血管收縮，導(dǎo)致心肌缺血而致心肌細(xì)胞凋亡[15]。而氯沙坦鉀對(duì)AngⅡ具有明顯拮抗作用，對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的凋亡有明顯的抑制作用[16]。故本實(shí)驗(yàn)采用氯沙坦鉀作為陽性對(duì)照組。

CHF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，同時(shí)伴有MF和心肌細(xì)胞凋亡的病理改變，且相互影響[17]，但關(guān)于二者之間相互影響的具體機(jī)制目前研究較少。有研究表明，二者可能存在共同發(fā)病機(jī)制，如與炎癥因子的過度表達(dá)有關(guān)[18]。本課題組研究認(rèn)為，TGF-β1/Smads信號(hào)通路的激活與二者的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。Bcl-2蛋白家族是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，其中Bax、Bcl-2蛋白與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組兔LVEF降低，血清NT-proBNP、AngⅡ含量增加，心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高，心肌組織Bax、TGF-β1、Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，提示CHF發(fā)生后，NT-proBNP、AngⅡ過度釋放入血，TGF-β1/Smad3信號(hào)通路被激活，膠原蛋白合成增加，發(fā)生了MF病理改變，同時(shí)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而導(dǎo)致心臟功能受損。與模型組比較，益心泰醇提物各劑量組與氯沙坦鉀組兔LVEF升高，血清NT-proBNP、AngⅡ含量減少，心肌細(xì)胞凋亡率明顯下降，心肌組織Bax、TGF-β1、Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，提示益心泰和氯沙坦鉀均可降低血清NT-proBNP、AngⅡ含量，抑制TGF-β1/ Smad3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)和膠原蛋白合成，改善MF和心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心臟。

綜上所述，益心泰醇提物通過抑制TGF-β1/ Smad3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，降低CHF兔血清NT-proBNP、AngⅡ含量，提高LVEF，抑制膠原蛋白合成，改善MF和心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心臟。

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Effects ofAlcohol Extract on Expressions of TGF-β1/Smad3 Signaling Pathway Related Factors in Rabbits with Adriamycin-induced Chronic Heart Failure

LEI Yang1, LUO Li2, GUO Zhihua2, WEI Jiaming2, LIU Chengxin2, LONG Yun3, TANG Yun3

To explore the effects ofalcohol extract on expressions of TGF-β1/Smad3 signaling pathway related factors in rabbits with adriamycin-induced chronic heart failure (CHF); To discuss its mechanism of action.A rabbit model of CHF was established by intravenous injection of doxorubicin in the ear. The successful CHF model of rabbits were randomly divided into control group, model group, losartan group (2.73 mg/kg) andalcohol extract low-, medium-, high-dosagegroup (1.77, 3.54, 7.08 g/kg). The corresponding drugs were given by gavage, and the model group and the control group were given an equal volume of distilled water by gavage, once a day, for 4 consecutive weeks. Echocardiography was used to detect the LVEF; ELISA was used to detect the contents of NT-proBNP and Ang Ⅱ in serum; TUNEL staining was used to detect cardiomyocyte apoptosis; Western blot was used to detect proteins expression of Bax , Bcl-2 , TGF-β1, Smad3, Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ in myocardial tissue.Compared with the control group, the LVEF in the model group decreased (<0.01); the contents of NT-proBNP and Ang Ⅱ in serum increased (<0.01); the apoptosis rate of cardiomyocyte increased (<0.01); the proteins expression of Bax, TGF-β1, Smad3, Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ in myocardial tissue increased, while the protein expression of Bcl-2 decreased (<0.01). Compared with the model group, the LVEF in each dosage ofalcohol extract group increased (<0.05); the contents of NT-proBNP and Ang Ⅱ in serum reduced (<0.05,<0.01); the apoptosis rate of cardiomyocyte was significantly decreased (<0.05,<0.01); the proteins expression of Bax, TGF-β1, Smad3, Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ in myocardial tissue decreased, while the protein expression of Bcl-2 increased, and the difference inalcohol extract high-dosage group was stastically significant (<0.05,<0.01).alcohol extract could improve rabbit myocardial fibrosis and inhibit myocardial cell apoptosis by regulating the TGF-β1/Smad3 signaling pathway, so as to play a role in treating CHF.

alcohol extract; chronic heart failure; cardiomyocyte apoptosis; myocardial fibrosis; TGF-β1/Smad3; rabbits

R285.5

A

1005-5304(2021)12-0045-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202104257

國家自然科學(xué)基金（81673955）；重大疑難疾病慢性心力衰竭中西醫(yī)臨床協(xié)作試點(diǎn)項(xiàng)目（2018年）；湖南省衛(wèi)生計(jì)生科研計(jì)劃項(xiàng)目（20200592、C20180710）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)國內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科（2018年）；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2018JJ2304）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（2021064）

唐云，E-mail：tangyun109@163.com

（2021-04-14）

（修回日期：2021-05-07；編輯：鄭宏）