血清微小RNA-181c、微小RNA-146a對(duì)急性腦梗死病人神經(jīng)功能缺損及預(yù)后的影響

李漢穎，李漢宇，李增祥

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是神經(jīng)系統(tǒng)多發(fā)病與常見(jiàn)病，致殘率、病死率較高，帶來(lái)的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)已成為全球性問(wèn)題，因此加強(qiáng)其研究意義重大。微小RNA（microRNA，miR）是高度保守的短小RNA，能通過(guò)對(duì)靶miR 的降解、翻譯、抑制介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，參與蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、進(jìn)展等過(guò)程中扮演重要角色。miR-181c、miR-146a 是miR 的兩個(gè)亞型，與首發(fā)精神分裂癥病人認(rèn)知功能損傷、腦卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化密切相關(guān)。但對(duì)ACI 病人神經(jīng)功能缺損及預(yù)后的影響尚不明確，本研究對(duì)此進(jìn)行探討，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取南陽(yáng)市中醫(yī)院2018年1月至2019年7月ACI 病人135 例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合ACI 診斷標(biāo)準(zhǔn)；首次發(fā)??；發(fā)病前無(wú)認(rèn)知功能異常、精神障礙、肢體功能障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤者；老年癡呆者；感染類疾病者；血液系統(tǒng)疾病者；繼發(fā)癲癇者；存在聽(tīng)力障礙者。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，病人均對(duì)本研究知情，自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1

神經(jīng)功能評(píng)估 入院時(shí)采用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評(píng)分（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)估病人神經(jīng)功能，滿分42分，分值越高，神經(jīng)缺損越嚴(yán)重。

1.2.2

標(biāo)本采集與檢測(cè) 入院時(shí)、入院第3 天分別采集病人肘部靜脈血5 mL，3500 r/min 離心15 min，取上清。加入細(xì)胞裂解液，總RNA 提取試劑盒（廣州健侖生物科技有限公司）提取總RNA，紫外分光光度法檢測(cè)提取總RNA 濃度與質(zhì)量，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京億迅生物科技有限公司）逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），miR-181c 正向、反向引物分別為5’-AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU-3’、5’-UCACCGACAGGUUGAAUGUUUU-3’，miR-146a 正向、反向引物分別為5’-GTTTACCTACTCGTCTCTGGTAC-3’、5’-CCTTATCCCAATACGTGTCGACATCAT-3’，反應(yīng)體系包括引物、dNTP（百奧邁科生物技術(shù)有限公司）、Taq DNA 聚合酶（北京藍(lán)博斯特生物技術(shù)有限公司）、靶序列DNA和PCR反應(yīng)緩沖液（南京億迅生物科技有限公司）共20 μL，PCR 反應(yīng)條件為95 ℃5 min 預(yù)變性，95 ℃40 s 變性，60 ℃20 s 退火，72 ℃15 s延伸，以2表示目的基因表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）對(duì)比不同神經(jīng)功能病人臨床資料。（2）比較不同NIHSS 評(píng)分病人血清miR-181c、miR-146a 水平。（3）分析血清miR-181c、miR-146a 與NIHSS評(píng)分相關(guān)性。（4）比較不同預(yù)后病人血清miR-181c、miR-146a 水平。（5）分析血清miR-181c、miR-146a 與預(yù)后的相關(guān)性。（6）分析血清miR-181c、miR-146a 預(yù)測(cè)預(yù)后的截?cái)嘀?、靈敏度、特異度。（7）比較血清miR-181c、miR-146a高危、低危病人生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

兩組年齡、發(fā)病至入院時(shí)間、體質(zhì)量指數(shù)等一般資料均衡可比（

P

＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評(píng)分（NIHSS）急性腦梗死病人臨床資料對(duì)比

2.2 不同NIHSS 評(píng)分病人血清miR-181c、miR-146a水平

NIHSS評(píng)分≥16分病人血清miR-181c水平高于5～15分、＜5分病人，miR-146a 水平低于5～15分、＜5分病人（

P

＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評(píng)分（NIHSS）急性腦梗死病人血清miR-181c、miR-146a水平比較/±s

2.3 血清miR-181c、miR-146a 與NIHSS 評(píng)分相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析，血清miR-181c與NIHSS評(píng)分呈正相關(guān)（

r

=0.704，

P

＜0.001），miR-146a 與NIHSS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（

r

=-0.695，

P

＜0.001）。

2.4 不同預(yù)后病人血清miR-181c、miR-146a 水平

根據(jù)30 d 預(yù)后分為生存者、死亡者。生存者入院時(shí)、入院第3 天血清miR-181c 水平低于死亡者，miR-146a水平高于死亡者（

P

＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同預(yù)后急性腦梗死病人血清miR-181c、miR-146a水平比較/±s

2.5 血清miR-181c、miR-146a 與預(yù)后的關(guān)系

以ACI病人預(yù)后作為因變量（生存=0，死亡=1），采用向后剔除法篩選變量，

α

=0.10，血清miR-181c、miR-146a 作為自變量（以所有病人平均值為界：≤平均值=1，＞平均值=2；血清miR-181c 平均值為1.50，miR-146a 平均值為0.70），logistic 回歸分析顯示，血清miR-181c、miR-146a 與預(yù)后顯著相關(guān)（

P

＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 血清miR-181c、miR-146a與135例急性腦梗死預(yù)后的關(guān)系

2.6 血清miR-181c、miR-146a 對(duì)預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC 曲線分析顯示，入院時(shí)第3 天miR-146a 預(yù)測(cè)預(yù)后的AUC 最大，為0.803，當(dāng)截?cái)嘀怠?.69 時(shí)，靈敏度為91.67%，特異度為68.18%。見(jiàn)表5。

表5 血清miR-181c、miR-146a對(duì)135例急性腦梗死預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC分析結(jié)果

2.7 生存分析

以入院第3 天ROC 曲線最佳截?cái)嘀禐榉纸?，分為miR-181c 高危（＞1.42）與低危（≤1.42）、miR-146a 高危（≤0.69）與低危（＞0.69）。miR-181c高危與低危（

χ

=16.201）、miR-146a高危與低危（

χ

=12.823）生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均

P

＜0.001）。

3 討論

3.1 研究的意義

目前ACI 的治療手段主要包括抗凝、溶栓、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等，雖能在一定程度上改善預(yù)后，但仍存在較大比例病人發(fā)生明顯的神經(jīng)功能缺損，導(dǎo)致功能障礙，并影響病人預(yù)后，因此研究與神經(jīng)功能缺損相關(guān)的分子機(jī)制至關(guān)重要。

3.2 血清miR-181c 對(duì)ACI 病人神經(jīng)功能缺損及預(yù)后的影響

miR-181c 來(lái)源于核內(nèi)基因組，可移位至線粒體，并影響其基因組編碼蛋白質(zhì)的合成。Ma等報(bào)道顯示，卒中病人的血miR-181c 水平與健康個(gè)體相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Zhang 等采用小核仁RNA 宿主基因6 靶向miR-181c，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元凋亡情況與空白對(duì)照呈現(xiàn)出顯著差異，提示miR-181c可調(diào)控神經(jīng)元的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，NIHSS評(píng)分≥16分病人血清miR-181c 水平高于5～15分、＜5分病人，且死亡病人入院時(shí)、入院第3 天miR-181c 高于生存者，提示神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重病人和死亡病人，血清miR-181c 水平較高，并與NIHSS 評(píng)分呈正相關(guān)，與預(yù)后顯著相關(guān)，表明miR-181c 可影響病人神經(jīng)功能與預(yù)后，可能為評(píng)估ACI 后神經(jīng)功能與預(yù)后提供了一個(gè)思路。王志等發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良腦梗死病人入院時(shí)血清miR-181c 水平高于預(yù)后良好者，與病人預(yù)后密切相關(guān)，本研究結(jié)論與之相似。miR-181c 可介導(dǎo)腦缺血后腫瘤壞死因子-α 等炎性因子的釋放，直接損傷神經(jīng)元，并能通過(guò)轉(zhuǎn)移至線粒體，調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，引起線粒體復(fù)合物Ⅳ的重構(gòu)與線粒體功能紊亂，減弱線粒體呼吸作用，加重缺血損傷與神經(jīng)功能缺損程度，故可影響病人預(yù)后。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-181c 高危與低危病人生存曲線存在顯著差異，直接佐證了miR-181c 表達(dá)水平可影響病人預(yù)后。且入院第3 天miR-181c 預(yù)測(cè)預(yù)后的AUC大于入院時(shí)，為0.779，呈現(xiàn)出較高的價(jià)值，可為臨床預(yù)測(cè)預(yù)后提供量化參考。

3.3 血清miR-146a 對(duì)ACI 病人神經(jīng)功能缺損及預(yù)后的影響

miR-146a 與細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫、炎癥和細(xì)胞凋亡高度相關(guān)。Zhou 等研究表明，腦缺血再灌注損傷后，miR-146a 表達(dá)下調(diào)，而采用miR-146a 模擬物上調(diào)miR-146a 的表達(dá)，有效降低了Caspase7 水平，減少了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，呈現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，NIHSS 評(píng)分≥16分病人血清miR-146a 水平，低于5～15分、＜5分病人，且死亡病人入院時(shí)、入院第3 天miR-146a 低于生存者，提示神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重病人和死亡病人，血清miR-146a水平較低，并與NIHSS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與預(yù)后顯著相關(guān)，表明檢測(cè)血清miR-146a 表達(dá)可評(píng)估病人神經(jīng)功能與預(yù)后，上調(diào)miR-146a 表達(dá)可能為ACI 病人神經(jīng)功能、預(yù)后的改善提供了一個(gè)潛在靶點(diǎn)。劉明等報(bào)道顯示，腦梗死病人血清miR-146a 表達(dá)與腦梗死病人NIHSS 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，支持本研究結(jié)論。關(guān)于miR-146a 改善神經(jīng)缺損與預(yù)后的機(jī)制可能有：（1）miR-146a 的上調(diào)，能通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)Janus 相關(guān)激酶2/轉(zhuǎn)錄激活因子3 信號(hào)通港路，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗缺血性損傷的神經(jīng)保護(hù)作用；（2）miR-146a 能通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞，抑制血管收縮，舒張血管，改善腦缺血狀態(tài)；（3）miR-146a高表達(dá)可抑制中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、趨化因子等，改善血液黏稠性，抑制血栓形成，有利于ACI后缺血灶血流的恢復(fù)。同時(shí)本研究顯示，以ROC分析最佳截?cái)嘀禐榉纸纾琺iR-146a 高危與低危者生存曲線比較差異顯著，再次證實(shí)miR-146a 對(duì)病人預(yù)后的影響。ROC分析顯示，入院時(shí)第3 天miR-146a 預(yù)測(cè)預(yù)后的AUC 最大，為0.803，當(dāng)截?cái)嘀怠?.69 時(shí)，靈敏度為91.67%，特異度為68.18%，可為臨床選取合適指標(biāo)預(yù)測(cè)預(yù)后提供參考。本研究不足之處在于，病例數(shù)較少，仍需后續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

血清miR-181c、miR-146a 與ACI 病人神經(jīng)功能缺損及預(yù)后顯著相關(guān)，均具有較高的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，可能為ACI病人神經(jīng)功能、預(yù)后的改善提供了一個(gè)潛在靶點(diǎn)。