聚天門冬氨酸尿素對稻田土壤細(xì)菌多樣性的影響

王 娜，徐嘉翼，葉 鑫，隋世江，張 鑫，牛世偉

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物營養(yǎng)與環(huán)境資源研究所，遼寧 沈陽 110161)

【研究意義】土壤微生物是物質(zhì)循環(huán)的調(diào)節(jié)者，對土壤有機(jī)物的分解和養(yǎng)分循環(huán)起關(guān)鍵作用，對維持生態(tài)平衡穩(wěn)定具有重要意義[1-3]。微生物作為土壤養(yǎng)分的源和庫[4]，可以固定礦質(zhì)養(yǎng)分，降低養(yǎng)分的損失；另外也參與有機(jī)質(zhì)礦化，釋放礦質(zhì)養(yǎng)分，滿足作物的需要。土壤微生物對環(huán)境變化較為敏感，除了氣候、土壤等自然因素，人為活動也會對微生物產(chǎn)生諸多影響。在農(nóng)田種植生產(chǎn)中，施肥是必要且常見的人為生產(chǎn)活動，其對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響已被廣泛報道[5-7]。合理施有機(jī)肥或無機(jī)肥均能提高稻田土壤微生物的數(shù)量和活性，進(jìn)而調(diào)控土壤氮素的循環(huán)轉(zhuǎn)化過程，提高土壤有效氮的濃度，促進(jìn)水稻根系對氮素吸收，因此研究肥料與土壤微生物之間的響應(yīng)關(guān)系對于理解土壤養(yǎng)分調(diào)控機(jī)制具有指導(dǎo)意義。目前稻田施用的氮肥大多數(shù)是常規(guī)尿素，其成本低、養(yǎng)分供應(yīng)快，但長期過量施用易引起養(yǎng)分流失、土壤酸化等問題[8]，導(dǎo)致周圍水體富營養(yǎng)化，同時造成土壤質(zhì)量降低，嚴(yán)重影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能。常規(guī)尿素利用率低，由此帶來的環(huán)境污染，一直是困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的問題[9]。為此，具有肥效長且穩(wěn)定、利用率高等特點的控釋肥料受到越來越多的關(guān)注，其對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響也成為研究熱點[10]。李新悅等[11]研究控釋摻混氮肥對稻麥土壤微生物的影響，結(jié)果表明在水稻拔節(jié)至成熟期，施用控釋摻混氮肥的土壤細(xì)菌數(shù)量較單施尿素提高了54.36%～66.96%，較單施控釋氮肥提高19.47%～69.92%。李杰等[12]研究新型聚氨酸增效肥料對土壤微生物量和活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新型聚氨酸增效肥料顯著增加了小白菜土壤微生物量，提高了土壤微生物活性，能夠有效延緩肥料氮素的釋放。聚天門冬氨酸/鹽(PASP)，是一種環(huán)境友好型綠色聚合物，具有生物降解特性及富集離子作用，既能提高肥料利用率，又能減少肥料流失給環(huán)境帶來的污染，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到大量應(yīng)用[13-14]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】杜中軍等[15]研究表明聚天門冬氨酸同源多肽分子與養(yǎng)分離子形成易于水稻吸收的螯合態(tài)，促進(jìn)水稻對養(yǎng)分的吸收。楊勇等[16]研究表明PASP能夠有效延長肥效，減少化肥流失，活化養(yǎng)分元素，提高化肥利用率，促進(jìn)水稻增產(chǎn)?！颈狙芯壳腥朦c】目前關(guān)于PASP研究主要集中在對水稻養(yǎng)分吸收及增產(chǎn)作用等方面，而對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等方面少有報道，尤其能否調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)并影響氮素釋放與轉(zhuǎn)化尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選用0.3%聚天門冬氨酸鈣鹽(PASP-Ca)與尿素復(fù)配，利用Illumina高通量測序技術(shù)分析稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征，探討PASP-Ca尿素對土壤微生物多樣性和氮素形態(tài)的影響。本研究以期掲示PASP與氮素-土壤-微生物間互作的生態(tài)學(xué)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗地位于盤錦市盤山縣壩墻子鎮(zhèn)煙李村，地處遼河三角洲，屬溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候類型，年均降雨量612 mm，年均氣溫8.4 ℃，無霜期165～170 d。供試土壤為水稻土，耕層土壤理化性質(zhì)為有機(jī)質(zhì)17.7 g/kg、全氮1.58 g/kg、水解性氮71 mg/kg、有效磷43.28 mg/kg、有效鉀185.5 mg/kg、pH 7.8。

1.2 供驗材料

供試水稻品種為鹽豐47號。5月12日施基肥，5月22日插秧，插秧密度為30 cm×16.5 cm，6月24日追蘗肥，10月8日收獲水稻。氮肥為大顆粒尿素(N 46%)、磷肥為磷酸二銨(P2O546%、N 18%)、鉀肥為氯化鉀(K2O 60%)、聚天門冬氨酸鈣鹽(PASP-Ca，用量為尿素重量0.3%)。

1.3 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)置2個處理，T1處理氮肥用常規(guī)尿素，T2處理氮肥用0.3% PASP-Ca復(fù)配常規(guī)尿素。各處理氮肥、磷肥和鉀肥用量均分別為N 210 kg/hm2、P2O590 kg/hm2和K2O 90 kg/hm2。氮肥施用比例為基肥占80%、蘗肥占20%，磷鉀肥全部基施。試驗面積為400 m2，每個處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。田間管理與當(dāng)?shù)叵嗤?/p>

1.4 樣品采集與測定

在施入基肥后第3、5、10 天，采用5點法取0～20 cm土壤樣品。一部分土壤樣品迅速裝入無菌聚氯乙烯(PVC)盒，置于冰上盡快運至實驗室于-80 ℃保存，用于微生物檢測。另一部分土壤樣品于-20 ℃保存，采用紫外分光光度計法測定土壤硝態(tài)氮濃度，靛酚藍(lán)比色法測定土壤銨態(tài)氮濃度[17]。

1.5 細(xì)菌測序

提取土壤總DNA，然后擴(kuò)增獲得的片段，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化和回收后，由北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行文庫構(gòu)建，Illumina MiSeq測序。

1.6 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析

1.6.1 原始數(shù)據(jù)序列分析 使用FLASH v 1.2.7軟件[18]，通過overlap對每個樣品的測序序列(reads)進(jìn)行拼接，得到的拼接序列即原始Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags)；使用Trimmomatic v 0.33軟件[19]，對拼接得到的Raw Tags進(jìn)行過濾，片段大小得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)；使用UCHIME v4.2軟件[20]，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。

1.6.2 操作分類單元分析 使用QIIME(version 1.8.0)軟件[21-22]中的UCLUST對Tags在97%相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得操作分類單元(OTU)，并基于Silva(細(xì)菌)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫[23]對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋和生物信息學(xué)統(tǒng)計分析。用R語言軟件繪制群落組成Venn圖，展示各處理樣品之間共有、特有OTUs數(shù)目。

1.6.3 細(xì)菌多樣性分析 利用Mothur軟件[24]計算Alpha多樣性指數(shù)(Ace、Chao、Shannon、Simpson)。Ace和Chao指數(shù)表示物種的數(shù)量，Shannon和Simpson指數(shù)表示物種的多樣性，相同物種豐富度的情況下，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明樣品的物種多樣性越高[25]。

1.6.4 細(xì)菌顯著差異分析 利用LEfSet[26][Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size]分析首先使用kruskal-Wallis秩和檢驗方法尋找多組間顯著差異的物種(P< 0.05)，然后根據(jù)第一步得到的差異物種使用線性判別分析計算每個物種的LDA值，最后根據(jù)LDA值篩選組間具有統(tǒng)計學(xué)差異的biomarker，進(jìn)行處理間物種差異顯著性分析。LEfSe分析進(jìn)化分枝圖由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至種的分類級別；在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比；著色原則為將無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，其他差異物種按該物種所在豐度最高的分組進(jìn)行著色。

1.6.5 物種與環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析 冗余分析法(Redundancy Analysis，RDA)是同時使用環(huán)境因子和物種組成數(shù)據(jù)進(jìn)行限制性排序的生態(tài)學(xué)多元數(shù)據(jù)分析方法，可以綜合分析多個環(huán)境因子，得出環(huán)境因子與物種之間的排序圖，圖中可直觀的顯示出物種分布和環(huán)境因子間的關(guān)聯(lián)，是分析生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間相關(guān)性的有效途徑[27]。

1.7 其它相關(guān)數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件中獨立樣本T檢驗對同采樣天數(shù)不同施肥處理間Alpha多樣性指數(shù)和土壤養(yǎng)分進(jìn)行差異性顯著分析；采用SPSS 19.0軟件中單因素分析方法(One-Way ANOVA)對同施肥處理不同采樣天數(shù)間Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌群落總體變化分析

2.1.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 18個土壤樣品共得到1030 357條序列，其中921 829條為優(yōu)質(zhì)序列，占所有序列的89.5%。平均每個樣品的序列條數(shù)為16 813，平均序列長度為421 bp。在相似度為97%水平上，18個土壤樣品中OTUs數(shù)為1188到1791，覆蓋了土壤中約為99.45%～99.84%的細(xì)菌，說明測序數(shù)據(jù)量合理，能真實反應(yīng)土壤細(xì)菌的群落組成。

2.1.2 土壤細(xì)菌OTUs Venn圖分析 從圖1可以看出，從施肥后第3天至第10天，常規(guī)尿素T1處理與PASP-CA尿素T2處理共有OTUs數(shù)呈先增加后降低趨勢，且顯著高于特有細(xì)菌，這表明兩個處理的OTUs數(shù)可能受尿素降解與轉(zhuǎn)化過程影響，且大部分細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似。在施肥后第5天，T1處理與T2處理OTUs總數(shù)最多，分別為1947 和1935種，兩處理共有OTUs數(shù)也最多，為1910種，這說明PASP-Ca尿素對施肥后第5天土壤細(xì)菌OTUs影響較小。而在施肥后第3、10天，T1處理和T2處理特有OTUs分別為18 和49種、24 和87種，且T2處理特有OTUs數(shù)均高于T1處理，而在第5天T2處理特有OTUs數(shù)低于T1處理，這表明PASP-Ca尿素增加了第3、10天土壤樣品中特有OTUs的數(shù)量。

2.1.3 土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù) 如表1所示，對各處理的OTUs進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)施肥后第3天至第10天，T1、T2處理ACE指數(shù)均呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，這表明隨著尿素的釋放與轉(zhuǎn)化，土壤細(xì)菌豐富度逐漸增加，在施肥后第5天達(dá)到峰值后呈不同趨勢下降。其中T1處理第5天ACE指數(shù)顯著高于第3、10天，T2處理第5、10天ACE指數(shù)顯著高于第3，5與10天差異不顯著，而T2處理第3天ACE指數(shù)高于T1處理，第5、10天ACE指數(shù)低于T1處理，無顯著差異，這說明PASP-Ca尿素可增加施肥初期細(xì)菌豐富度且保持施肥后期細(xì)菌豐富度相對穩(wěn)定。兩個處理Chao指數(shù)也呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，其中T1處理第5天Chao指數(shù)顯著高于第3、10天，而T2處理第3、5、10天Chao指數(shù)差異不顯著，且在第10天T2處理Chao指數(shù)顯著高于T1處理，這也表明隨著尿素的釋放與轉(zhuǎn)化，常規(guī)尿素處理細(xì)菌豐富度變化較大而PASP-Ca尿素能夠保持細(xì)菌豐富度相對穩(wěn)定。施肥后第3天，T2處理Shannon指數(shù)高于T1處理，且T2處理Simpson指數(shù)低于T1處理，無顯著差異，這表明在施肥初期，PASP-Ca尿素具有增加土壤細(xì)菌多樣性的潛力。

表1 各個處理Alpha多樣性指數(shù)值

2.2 土壤N素硝化相關(guān)細(xì)菌變化

2.2.1 土壤細(xì)菌群落組成 選擇物種豐度比例大于1%的前10個優(yōu)勢物種繪制目水平分布柱狀圖(圖2)，并對與氮素循環(huán)相關(guān)的細(xì)菌進(jìn)行差異顯著性分析(表2)。從圖2中可以看出，T1、T2處理土壤樣品中50%左右為其他物種，10%～20%未能進(jìn)行分類鑒定。除此之外，Nitrosomonadales(亞硝化單胞菌目)相對豐度最高，其可能是參與氮素循環(huán)的主要貢獻(xiàn)者，其次為Xanthomonadales(黃單胞桿菌目)、Nitrospirales(硝化螺旋菌目)和Sphingobacteriales(鞘脂桿菌目)。在施肥后第3天，T1處理細(xì)菌相對豐度高于T2處理的優(yōu)勢目有：Xanthomonadales，T1處理為9.16%、T2處理為7.32%；其次是Sphingobacteriales，T1處理為4.74%、T2處理為4.47%；而T2處理物種相對豐度高于T1處理的優(yōu)勢目有：主要以未分類細(xì)菌為主，占比為11.34%；其次是Nitrosomonadales，T1處理為4.90%、T2處理為5.64%。在施肥后第5天，T1處理細(xì)菌相對豐度高于T2處理的優(yōu)勢目有：Nitrosomonadales，T1處理為8.47%、T2處理為5.69%；其次是Nitrospirales，T1處理為4.39%、T2處理為3.29%；而T2處理物種相對豐度高于T1處理的優(yōu)勢目有：主要以未分類細(xì)菌為主，占比為18.76%；其次是Sphingobacteriales，T1處理為2.33%、T2處理為2.53%。在施肥后第10天，T1處理物種相對豐度高于T2處理的優(yōu)勢目有：Nitrosomonadales，T1處理為9.73%、T2處理為7.76%；其次是Nitrospirales，T1處理為3.64%、T2處理為2.93%；而T2處理物種相對豐度高于T1處理的優(yōu)勢目有：主要以未分類細(xì)菌為主，占比為15.28%；Xanthomonadales，T1處理為3.60%、T2處理為4.01%?？梢?，常規(guī)尿素T1處理和PASP-Ca尿素T2處理的優(yōu)勢物種細(xì)菌群落組成基本一樣，但優(yōu)勢物種細(xì)菌相對豐度存在一定差異。

表2 施肥后第3、5、10天與氮素循環(huán)相關(guān)細(xì)菌目水平的相對豐度

表3 施肥后第3、5、10天土壤細(xì)菌屬水平LDA打分

如表2所示，在施肥后第3、5和10天，Nitrosomonadales相對豐度呈逐漸增加趨勢，其中T1處理第5、10天相對豐度顯著高于第3天，而T2處理各時期差異不顯著；Nitrospirales相對豐度呈先增加后減少趨勢，T1處理第5天其相對豐度顯著高于第3天，而T2處理各時期差異不顯著；Xanthomonadales、Sphingobacteriales相對豐度呈逐漸減少趨勢，T1、T2處理第3天其相對豐度顯著高于第5、10天。由此可見，在施肥后第3、5和10天，T2處理中與N素硝化相關(guān)的Nitrosomonadales、Nitrospirales相對豐度穩(wěn)定，這可能與添加PASP-Ca有關(guān)。

2.2.2 土壤細(xì)菌屬水平差異分析 根據(jù)LEfSe分析兩組間豐度差異顯著的物種，紅色節(jié)點表示在常規(guī)尿素T1處理的土壤中起重要作用的細(xì)菌類群，綠色節(jié)點表示在PASP-CA尿素T2處理的土壤中起重要作用的細(xì)菌類群(圖3)。如圖3所示，在施肥后第3、10天，T1和T2處理均有差異顯著的物種，而在第5天，T1處理有3種差異顯著的物種，T2處理無差異顯著的物種。由于土壤細(xì)菌測序獲得的數(shù)據(jù)量較大，將LEfSe分析結(jié)果結(jié)合LDA打分篩選出LDAScore>3差異顯著的菌屬(表3)。如表3所示，在施肥后第3天，以Gillisia(泥灘微菌屬)、Lysobacter(溶桿菌屬)、Pontibacter(海洋桿菌屬)等為主的細(xì)菌在T1處理的土壤菌群結(jié)構(gòu)組成起到重要作用。Subgroup 7、Nitrospiraceae(硝化螺旋菌科)在T2處理的土壤菌群結(jié)構(gòu)組成起到重要作用。在施肥后第5天，Gillisia、Pontibacter、Geobacter(地桿菌屬)在T1處理的土壤菌群結(jié)構(gòu)組成起到重要作用。在施肥后第10天，以Gemmatimonadaceae(芽單胞菌科)、Nitrosomonadaceae(亞硝化單胞科)、Latescibacteria(匿桿菌門)等為主的細(xì)菌在T1處理的土壤菌群結(jié)構(gòu)組成起到重要作用。Bacillus(芽孢桿菌屬)、Psenudomonas(熒光假單胞菌屬)、Streptomyces(鏈霉菌屬)在T2處理的土壤菌群結(jié)構(gòu)組成起到重要作用。上述細(xì)菌主要功能與生物防治、生物修復(fù)、有機(jī)肥降解以及氮循環(huán)等相關(guān)，其中與N素硝化相關(guān)的細(xì)菌主要有Nitrospiraceae和Nitrosomonadaceae。在施肥第3天，Nitrospiraceae是T2處理土壤菌群重要組成部分，而在施肥后第10天，Nitrosomonadaceae是T1處理土壤菌群重要組成部分。

表4 不同處理土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量

2.3 土壤氮素含量變化分析

2.4 細(xì)菌群落與土壤氮素的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

聚天門冬氨酸/鹽(PASP)是一種氨基酸類聚合物，天然的聚天門冬氨酸主要存在于軟體動物和蝸牛類的殼中[28]。聚天門冬氨酸分子具有類似于蛋白質(zhì)的酰胺鍵結(jié)構(gòu)，微生物中相應(yīng)的酶能夠進(jìn)入PASP的活性位點，使結(jié)構(gòu)主鏈發(fā)生分解并斷裂成片段，最終分解為小分子物質(zhì)(CO2、H2O)，實現(xiàn)完全生物降解[29]。PASP-Ca與尿素復(fù)配后可包裹在尿素的外層，通過自身緩慢的生物降解逐漸釋放尿素，使氮肥在水稻生育期內(nèi)持續(xù)發(fā)揮作用，同時PASP-Ca還能夠鰲合、吸附田面水和土壤中的養(yǎng)分輸送并富集到水稻根系周圍，供水稻吸收利用，這將大大地減少氮素流失與揮發(fā)[30-31]。本試驗中，通過對各處理的OTUs Venn分析，結(jié)果顯示：從施肥后第3～10天，兩個處理的OTUs數(shù)呈先增加后降低趨勢，且兩個處理的大部分細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，而PASP-Ca尿素能夠增加第3、10天土壤樣品中特有OTUs的數(shù)量。通過對各處理的OTUs進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析，結(jié)果顯示：施肥后第3天至第10天，兩個處理的ACE指數(shù)和Chao指數(shù)呈現(xiàn)增加后降低趨勢，其中T1處理第5天ACE指數(shù)顯著高于第3、10天，T2處理第5、10天的ACE指數(shù)顯著高于第3天，第5天與第10天差異不顯著，且T2處理第3天ACE指數(shù)高于T1處理。這表明隨著尿素的釋放與轉(zhuǎn)化，土壤細(xì)菌豐富度逐漸增加，常規(guī)尿素處理細(xì)菌豐富度變化較大而PASP-Ca尿素處理可增加施肥初期細(xì)菌豐富度且保持施肥后期細(xì)菌豐富度相對穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

本文通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析表明，PASP-Ca尿素通過調(diào)控參與N素硝化的土壤細(xì)菌豐度，改變了土壤細(xì)菌群落多樣性，影響N素的硝化過程，對降低氮素流失風(fēng)險和提高氮肥利用率具有潛在作用。本試驗僅開展1年，因此有必要通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗和大田多年定點試驗深入研究PASP與土壤微生物和土壤養(yǎng)分之間的互作關(guān)系。