貓爪草對(duì)缺血再灌注小鼠急性腎損傷的作用及機(jī)制*

余婷，張妮，陳思羽，王笑笑，左思洋，郭兵，劉麗榮*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004;3.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省常見(jiàn)慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是指由腎臟結(jié)構(gòu)或功能變化引起腎功能在48 h內(nèi)急速下降而引起的一種臨床綜合征[1]，具有高發(fā)病率、高致死率等特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，住院患者中成人AKI相關(guān)發(fā)病率為21.6%、死亡率為23.9%[2]。缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)是臨床AKI最常見(jiàn)的誘因，常見(jiàn)于器官移植手術(shù)、心臟病、急性大失血等[3]，炎癥反應(yīng)在IR所導(dǎo)致AKI的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。IR過(guò)程中炎癥細(xì)胞募集、活化并分泌相應(yīng)的炎癥因子和激活補(bǔ)體系統(tǒng)，損傷腎血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞，導(dǎo)致腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損和腎功能下降[5-6]。表觀遺傳學(xué)通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，參與IR-AKI的發(fā)生發(fā)展[7]，其中組蛋白甲基化可通過(guò)改變?nèi)旧w的空間結(jié)構(gòu)和狀態(tài)調(diào)控基因的表達(dá)，從而促進(jìn)AKI的發(fā)生。貓爪草(ranunculus ternatus thunb，RTT)別名三散草、小毛茛等，系毛茛科植物小毛茛的干燥塊根，因其形似貓爪而得名。研究表明RTT含有多糖、黃酮、有機(jī)酸以及揮發(fā)油等生物活性成分[8]，具有抗腫瘤、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等作用，可能通過(guò)下調(diào)炎癥因子表達(dá)調(diào)節(jié)免疫環(huán)境，從而發(fā)揮抗炎作用[9-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，RTT對(duì)AKI具有緩解作用，其可能機(jī)制尚未明確。因此本研究旨在觀察RTT是否能預(yù)防性緩解IR-AKI所引起的腎功能降低及腎組織損傷，并探討其可能機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療AKI提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1藥物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 RTT購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥房。無(wú)特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量為(18±2)g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，批號(hào)SCXK(京)2018-0002。

1.1.2實(shí)驗(yàn)器材及試劑 全自動(dòng)生化分析儀(c702)購(gòu)自Cobas公司，二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天公司，高速冷凍離心機(jī)和凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜槽購(gòu)自北京六一公司，免疫組化試劑盒購(gòu)自中杉金橋公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自Bioss公司，光學(xué)顯微鏡購(gòu)自耐博公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自博奧森公司；β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自Bioss公司，中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)抗體、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)抗體、組蛋白H3(Histone H3，H3)抗體、組蛋白H3賴氨酸36三甲基化(tri-methylation of Histone H3 lysine 36，H3K36me3)抗體、組蛋白H3賴氨酸4三甲基化(tri-methylation of Histone H3 lysine 4，H3K4me3)抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1RTT水提物制備 100 g RTT干燥塊根，加雙蒸水(double distilled water，ddH2O)750 mL浸泡2 h，100 ℃條件下浸提0.5 h，紗布過(guò)濾，濾液濃縮至水提濃縮浸液500 mL。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù) 15只C57BL/6小鼠在清潔環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、IR組、RTT預(yù)處理組(IR+RTT組)，每組5只。IR+RTT組術(shù)前14 d每天按2 g/kg劑量予 RTT水提物預(yù)灌胃處理(RTT藥物濃度為課題組前期研究確定)，sham組和IR組灌胃等體積的ddH2O。

1.2.3IR模型構(gòu)建 IR組和IR+RTT組大鼠采用雙側(cè)腎蒂夾閉方式構(gòu)建小鼠IR模型，方法如下：術(shù)前禁食8 h，自由飲水；小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(65 mg/kg)麻醉，沿腹中線兩側(cè)0.5 cm處作縱形切口，暴露雙側(cè)腎臟；用無(wú)創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂，可觀察到腎臟顏色由鮮紅色變?yōu)樽虾谏?5 min后松開(kāi)微動(dòng)脈夾，觀察到腎臟顏色在短時(shí)間內(nèi)由紫黑色變?yōu)轷r紅色(提示腎臟恢復(fù)血供)，表明IR過(guò)程已完成，模型構(gòu)建成功，縫合腹腔。sham組僅鈍性剝離腎蒂，不阻斷腎臟血流，其余操作同上所述。

1.2.4標(biāo)本收集 IR模型構(gòu)建成功24 h后，用戊巴比妥鈉(65 mg/kg)腹腔內(nèi)麻醉小鼠，摘除眼球取血液，分離血清，用于檢測(cè)腎功能指標(biāo)。開(kāi)腹取雙側(cè)腎臟，均勻切分為兩份，一份固定于40 mL/L多聚甲醛液中，用于腎組織病理分析、免疫組織化學(xué)等；另一份存放于-80 ℃冰箱，用于Western blot和后續(xù)檢測(cè)。

1.2.5血肌酐(serum creatinine，Scr)及尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)檢測(cè) 小鼠全血室溫靜置1 h，4 000 r/min，離心5 min，吸取血清，用全自動(dòng)生化分析儀(Cobas 702)檢測(cè)各組小鼠血清Scr和BUN水平。

1.2.6腎組織學(xué)檢查 將多聚甲醛(40 mL/L)固定24 h以上的腎組織脫水、包埋，制成3 μm厚的石蠟切片，蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.7免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)腎臟NGAL和TNF-α表達(dá) 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇水化，高壓修復(fù)抗原，30 mL/L H2O2室溫下滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清工作液室溫下封閉非特異性位點(diǎn)，分別加入NGAL(1 ∶2 000)、TNF-α(1 ∶300)抗體4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育30 min，DAB顯色液在顯微鏡下顯色，陽(yáng)性染色為棕黃色，自來(lái)水沖洗、蘇木素復(fù)染、自來(lái)水反藍(lán)、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片、光學(xué)顯微鏡觀察，ImageJ 1.4軟件分析TNF-α和NGAL蛋白表達(dá)。

1.2.8Western blot檢測(cè)腎組織勻漿中NGAL、H3K36me3、H3K4me3蛋白表達(dá) -80 ℃冰箱取出腎組織，加入蛋白裂解液充分研磨后取勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清；采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用Excel 2016軟件計(jì)算樣本的蛋白濃度，配置蛋白上樣品，煮沸變性、自然冷卻；12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、聚偏氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜、50 g/L脫脂牛奶封閉1 h，分別加入β-actin(1 ∶5 000)、H3(1 ∶10 000)、NGAL(1 ∶1 000)、H3K36me3(1 ∶1 000)、H3K4me3(1 ∶300)抗體4 ℃搖床孵育過(guò)夜，二抗室溫?fù)u床孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑顯影。ImageJ 1.4軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為NGAL的內(nèi)參。H3作為H3K36me3和H3K4me3的內(nèi)參，Excel 2016軟件計(jì)算NGAL、H3K36me3、H3K4me3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清Scr、BUN的變化

生化檢測(cè)結(jié)果顯示，與sham組相比，IR組小鼠血清Scr、BUN均增高(P<0.05)；與IR組相比，IR+RTT組小鼠血清Scr、BUN均降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 腎組織觀察

HE染色結(jié)果顯示：sham組可見(jiàn)腎小管、腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯病理改變；IR組腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、脫落、壞死，腎小管的管腔中出現(xiàn)大量細(xì)胞碎屑；與IR組比較，IR+RTT組小鼠的腎組織病理改變明顯改善。見(jiàn)圖2。

注：(1)與sham組比較，P<0.05；(2)與IR組比較，P<0.05。圖1 各組小鼠血清Scr、BUN的表達(dá)Fig.1 The serum level of Scr and BUN in each group

圖2 各組小鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE,×200)Fig.2 Morphological structure change of kidney tissues in each group (HE,×200)

2.3 腎組織NGAL蛋白表達(dá)

IHC染色結(jié)果顯示：sham組腎小管上皮細(xì)胞幾乎無(wú)NGAL表達(dá)；與sham組相比，IR組小鼠的腎小管上皮細(xì)胞中NGAL增加(P<0.05)；與IR組相比，IR+RTT組小鼠的腎小管上皮細(xì)胞NGAL減少(P<0.05)；見(jiàn)圖3。Western blot結(jié)果顯示：sham組小鼠腎組織NGAL蛋白僅有少量表達(dá)；與sham組相比，IR組小鼠腎組織NGAL蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)；與IR組相比，IR+RTT組小鼠腎組織NGAL蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：A為IHC染色結(jié)果，B為結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；圖A中黑色箭頭所指為陽(yáng)性區(qū)域；(1)與sham組比較，P<0.05；(2)與IR組比較，P<0.05。圖3 各組小鼠腎組織NGAL蛋白表達(dá)(IHC)Fig.3 The levels of cleaved NGAL protein expression in kidney tissues of each group (IHC)

注：A為Western blot結(jié)果，B為結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；(1)與sham組比較，P<0.05；(2)與IR組比較，P<0.05。圖4 各組小鼠腎組織勻漿中NGAL蛋白表達(dá)(Western blot)Fig.4 The level of NGAL protein expression in kidney tissues of each group(Western blot)

2.4 腎組織TNF-α蛋白表達(dá)

IHC結(jié)果顯示：sham組小鼠腎小管上皮細(xì)胞幾乎無(wú)TNF-α表達(dá)；與sham組相比，IR組小鼠腎小管上皮細(xì)胞TNF-α明顯增加(P<0.05)；與IR組相比，IR+RTT組小鼠腎小管上皮細(xì)胞TNF-α明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

注：A為IHC染色結(jié)果，B為結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；圖A中黑色箭頭所指為陽(yáng)性區(qū)域；(1)與sham組比較，P<0.05；(2)與IR組比較，P<0.05。圖5 各組小鼠腎組織TNF-α蛋白表達(dá)變化(IHC)Fig.5 The level of TNF-α protein expression in kidney tissues of each group (IHC)

2.5 腎組織勻漿中H3K36me3、H3K4me3蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示：sham組小鼠腎組織勻漿中H3K36me3、H3K4me3蛋白僅有少量表達(dá)；與sham組相比，IR組腎組織勻漿中H3K36me3、H3K4me3蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.05)；與IR組相比，IR+RTT組腎組織勻漿中H3K36me3、H3K4me3蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

注：A為Western blot結(jié)果，B、C為結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；(1)與sham組比較，P<0.05；(2)與IR組比較，P<0.05。圖6 各組小鼠腎組織H3K36me3、H3K4me3蛋白表達(dá)變化(Western blot)Fig.6 Expression of H3K36me3 and H3K4me3 protein determined in kidney tissues of each group(Western blot)

2.6 腎組織H3K36me3、H3K4me3、TNF-α與NGAL的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：IR-AKI小鼠腎組織H3K36me3、H3K4me3、TNF-α與NGAL表達(dá)水平均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.739，P<0.05；r=0.782，P<0.05；r=0.713，P<0.05)。

3 討論

AKI是臨床上高發(fā)的一類腎病綜合征，具有高發(fā)病率、高致死率、多并發(fā)癥、病因復(fù)雜以及患者預(yù)后較差等特點(diǎn)，其預(yù)防和治療成為眾多學(xué)者的熱點(diǎn)研究話題。AKI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，參與因素眾多[11]。其中，炎癥反應(yīng)是AKI發(fā)生發(fā)展的主要環(huán)節(jié)之一[4]。IR時(shí)炎癥細(xì)胞轉(zhuǎn)移到炎癥部位，活化并分泌相應(yīng)的炎癥因子如促炎因子TNF-α(炎癥損傷的標(biāo)志性蛋白)等[12]，導(dǎo)致腎血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞受損，促進(jìn)AKI的發(fā)生發(fā)展[5-6]。RTT具有價(jià)格低廉、藥用價(jià)值高、開(kāi)發(fā)潛力大等優(yōu)點(diǎn)，其有效生物活性成分具有抗癌、抗菌、抗結(jié)核、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[13]。目前臨床上常用于輔助治療腫瘤、結(jié)核等，療效顯著且無(wú)明顯的毒副作用[14]。一定濃度的RTT可能通過(guò)激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，從而提升機(jī)體免疫力[15]。RTT具有抗急性炎癥的作用，在急性肝損傷小鼠中可發(fā)揮抗氧化、降低炎性因子的分泌、減輕以及修復(fù)肝組織炎癥損傷的作用[16-17]。迄今為止，RTT對(duì)IR-AKI的作用及可能機(jī)制未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。腎組織NGAL可作為AKI早期、特異性的診斷標(biāo)志物[18]。本研究結(jié)果顯示，小鼠腎臟在IR 24h后，腎功能指標(biāo)Scr和BUN升高(P<0.05)，腎組織形態(tài)學(xué)發(fā)生病理改變，腎損傷分子NGAL表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，提示IR-AKI模型構(gòu)建成功。與IR組相比，IR+RTT組小鼠Scr和BUN降低(P<0.05)，腎組織病理改變明顯改善，NGAL表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，提示RTT對(duì)IR-AKI小鼠腎功能及腎組織損傷具有緩解作用。與sham組相比，IR組小鼠腎組織TNF-α上調(diào)(P<0.05)；與IR組相比，IR+RTT組小鼠腎組織TNF-α下調(diào)(P<0.05)；提示RTT可抑制炎癥因子的表達(dá)從而發(fā)揮抗炎作用，緩解IR-AKI小鼠腎功能和腎組織損傷。

研究表明，表觀遺傳學(xué)通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，參與IR-AKI的過(guò)程[7,19]。表觀遺傳學(xué)是指在基因序列不發(fā)生改變的情況下，由于組蛋白修飾、DNA甲基化、非編碼RNA調(diào)控以及染色質(zhì)重塑等引起可遺傳的表型改變[20]。組蛋白甲基化作為表觀遺傳學(xué)的重要修飾方式之一，可調(diào)節(jié)DNA與組蛋白結(jié)合的緊密程度，改變?nèi)旧w的空間結(jié)構(gòu)和狀態(tài)，引起特定基因表達(dá)異常和功能改變，從而促進(jìn)AKI的發(fā)生發(fā)展[19,21]。組蛋白甲基化是由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶催化的一種可逆的酶促反應(yīng)[22]，參與多種炎癥免疫反應(yīng)[23]。組蛋白上有許多位點(diǎn)可以被甲基化修飾(尤其是賴氨酸)，可抑制或激活基因轉(zhuǎn)錄，其中H3K36me3、H3K4me3修飾屬于組蛋白甲基化修飾的一種，與基因轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，H3K36me3在順鉑致AKI和糖尿病腎病中表達(dá)上調(diào)，推測(cè)其可能參與了腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)在顯性遺傳多囊腎小鼠腎組織中，通過(guò)上調(diào)H3K36me3的表達(dá)，可促進(jìn)多囊腎的形成[24]。H3K4me3在炎癥、代謝疾病等進(jìn)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用[25-26]，也可參與調(diào)控多種促炎因子的轉(zhuǎn)錄激活，影響炎癥反應(yīng)[27]。下調(diào)H3K4me3的表達(dá)可能通過(guò)抑制腎臟炎癥反應(yīng)，從而緩解腎組織的損傷[28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IR組小鼠腎組織H3K36me3、H3K4me3蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)，并伴有腎功能受損，且可見(jiàn)明顯的腎臟病理學(xué)改變；IR+RTT組H3K36me3、H3K4me3蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，腎功能及腎組織病理學(xué)明顯改善。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，小鼠腎組織H3K36me3、H3K4me3、TNF-α與NGAL表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系。結(jié)合上述結(jié)果，提示RTT可能通過(guò)下調(diào)H3K36me3、H3K4me3、TNF-α表達(dá)，進(jìn)而抑制腎臟炎癥反應(yīng)，預(yù)防IR-AKI小鼠腎功能降低和腎組織損傷。

綜上所述，RTT對(duì)IR-AKI小鼠腎功能降低及腎組織損傷具有預(yù)防作用，其機(jī)制可能與下調(diào)H3K36me3、H3K4me3、TNF-α表達(dá)進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究可以為臨床預(yù)防和治療AKI提供參考，也將為RTT藥理作用的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)，但仍有很大局限，有待進(jìn)一步研究。