腐霉利人工抗原制備研究

胡驍飛，邢云瑞，孫亞寧，龐杏豪,，王 耀

（1河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471023）

0 引言

隨著國(guó)家法律法規(guī)的逐步健全及食品安全監(jiān)控檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，近年來(lái)，中國(guó)食品安全水平得到大幅度地提高。然而食品安全生產(chǎn)是一個(gè)涉及范圍廣泛的產(chǎn)業(yè)，影響因素復(fù)雜多樣。農(nóng)藥殘留超標(biāo)是其中一個(gè)重要影響因子。腐霉利(PCM)是一種殺菌劑類的農(nóng)藥，商品名稱速克靈，撲滅寧，殺霉利，環(huán)丙胺，撲滅酮，菌核利等，主要用于防治作物、蔬菜、水果的菌核病，灰霉病，黑斑病等[1-4]。PCM良好的抗菌作用使其在世界范圍得到廣泛應(yīng)用，而其在作物中的殘留對(duì)人及動(dòng)物均會(huì)產(chǎn)生危害[5-7]。為了減少PCM通過(guò)食物鏈危害消費(fèi)者健康，世界多國(guó)均對(duì)食品中PCM制定出最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，中國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2763-2016也對(duì)不同的蔬菜及食品中PCM殘留確定了最高限量標(biāo)準(zhǔn)，比如韭菜中限量為200μg/kg，食用植物油中為500μg/kg。為了能夠有效地監(jiān)控檢測(cè)食品中PCM殘留，研究人員建立了各種PCM檢測(cè)方法，主要是理化檢測(cè)方法，包括色譜法及其衍生方法，如高效液相色譜法[8]，二極管陣列檢測(cè)器與高效液相色譜聯(lián)用法[9-10]，反相高效液相色譜法[11]，氣相色譜法[12]，氣相色譜電子俘獲器檢測(cè)法[13-14]；色譜質(zhì)譜聯(lián)用，如氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16]，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17-18]；近紅外光譜法[19]；毛細(xì)管電泳法[20-21]等。理化檢測(cè)方法靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，因此往往被作為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。但理化檢測(cè)方法耗時(shí)比較長(zhǎng)，儀器昂貴，樣品前處理比較復(fù)雜，限制了其普及應(yīng)用。免疫學(xué)檢測(cè)方法靈敏度高，檢測(cè)速度快，因而在農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但對(duì)于PCM檢測(cè)的免疫學(xué)方法還比較少，鄒強(qiáng)等[22]制備PCM單克隆抗體建立了相應(yīng)的阻斷ELISA檢測(cè)方法，靈敏度（半數(shù)抑制濃度IC50）為71ng/mL。盡管這一靈敏度可以滿足中國(guó)檢測(cè)農(nóng)作物、蔬菜、水果中PCM最高殘留限量要求，但如果用于制備更快速、簡(jiǎn)單的免疫學(xué)檢測(cè)試紙時(shí)，考慮到樣品中PCM提取率，樣品基質(zhì)效應(yīng)消除等因素，其靈敏度可能無(wú)法滿足需求。因此，需要制備更靈敏的PCM單抗隆抗體，以便用于研制高靈敏度的PCM檢測(cè)試紙。本研究擬利用琥珀酸酐法對(duì)PCM進(jìn)行分子改造，然后采用碳二亞胺法將改造后的PCM與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)制備PCM的人工抗原，并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行鑒定，為PCM抗體的制備及后續(xù)免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑、動(dòng)物與儀器

1.1.1 試驗(yàn)試劑、動(dòng)物 PCM購(gòu)自阿拉丁生化科技股份有限公司。弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)購(gòu)自Sigma公司。1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購(gòu)自 Thermo Fisher Scientific（中國(guó)）公司。羊抗鼠酶標(biāo)二抗(GaMIgGHRP)購(gòu)自華美生物工程有限公司。無(wú)水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、琥珀酸酐(SA)等常規(guī)試劑均是分析純級(jí)或更高級(jí)，由市場(chǎng)采購(gòu)。0.01 M pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)，洗滌液(PBS+0.005%Tween-20,PBST)，0.05M pH 9.6碳酸鹽緩沖液(CBS)，雙蒸水(DDW)，均由實(shí)驗(yàn)室自備。BALB/c小鼠，購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。本試驗(yàn)于2020年1—9月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 儀器 NanoDrop One微量分光光度儀（Thermo Fisher Scientific公司），MS 3B渦旋震蕩器（德國(guó)IKA公司），ME204E萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Mettler Toledo公司），HI9321 pH計(jì)（美國(guó)Hanna公司）。550酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 PCM人工抗原的合成

采用琥珀酸酐法改造PCM分子，EDC法將其與載體蛋白偶聯(lián)，具體路線見圖1。

圖1 PCM分子改造及人工抗原合成路線圖

稱取PCM 21.7 mg，琥珀酸酐7.6 mg，溶于1 mL無(wú)水DMF中混合均勻，再加入無(wú)水三氯化鋁26.7 mg，此時(shí)溶液為無(wú)色澄清溶液。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)120 h。

向上述溶液中加入5 mL DDW，測(cè)定溶液pH。加入1 mL二氯甲烷，震蕩后靜置5 min，棄上層水相，留下層有機(jī)相。再向有機(jī)相中加入5 mL DDW，震蕩后靜置5 min，棄上層水相，留下層有機(jī)相。重復(fù)上述操作4次，相當(dāng)于水洗二氯甲烷（有機(jī)相）5次。把有機(jī)相用氮?dú)獯蹈?，得到改造后的PCM-SA。

2 mL DMF溶解PCM-SA，然后加入22.0 mg EDC，13.4 mg NHS，混勻后得澄清溶液。取出1 mL，向其中加入1 mL含有50.5 mg BSA的DMF溶液。剩余的PCM-SA溶液中加入1 mL含有33.9 mg OVA的DMF溶液。反應(yīng)4 h，對(duì)PBS透析72 h，4～8 h換透析液一次。收集透析后的溶液，5000 r/min，離心5 min，留上清，棄沉淀。NanoDrop one測(cè)定上清濃度，測(cè)定6次。

1.3 PCM人工抗原的鑒定

1.3.1 紫外掃描鑒定 把制備好的人工抗原PCM-SABSA，BSA溶液及PCM溶液用PBS稀釋到大致相同的濃度。用NanoDrop One微量分光光度儀掃描紫外吸收光譜，對(duì)比PCM-SA-BSA、BSA和PCM間紫外吸收的最大吸收峰位置的偏移，根據(jù)最大吸收峰是否偏移來(lái)初步分析PCM人工抗原是否制備成功[23]。

1.3.2 SDS-PAGE凝膠電泳鑒定 十二烷基硫酸鈉(SDS)是常用的陰離子表面活性劑，能夠讓蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵斷開，并消除不同種類蛋白質(zhì)間本來(lái)的電荷差異，使蛋白質(zhì)電泳遷移率只受蛋白質(zhì)分子量決定。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)是蛋白質(zhì)分離鑒定的最常用的方法。采用5%(w/v)的濃縮膠和10%(w/v)的分離膠，考馬斯亮藍(lán)染色，以冰醋酸-甲醇溶液為脫色液脫色[24]。

1.3.3 動(dòng)物免疫 選取3只6～8周齡健康的雌性BALB/c小鼠，用PCM-SA-BSA進(jìn)行免疫，免疫劑量為每只小鼠每次200μL含有5μg人工抗原的乳化液。背部皮下4點(diǎn)注射。免疫間隔3～5周。共免疫4次。首次免疫，將人工抗原用滅菌的PBS稀釋到10μg/mL，然后加入等量的FCA，完全乳化后注射。以后3次免疫，均是用FIA取代FCA，其他試劑用量及過(guò)程不變。

第4次免疫10天后，斷尾采血10μL，加入到990μL PBS中，5000 r/min離心10 min，棄沉淀，留上清用于測(cè)定血清效價(jià)及敏感性。

采用間接ELISA測(cè)定血清效價(jià)；間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定血清敏感性[24]，甲醇溶解的PCM用PBS分別稀釋到256、128、64、32、16、8、4 μg/mL及2 μg/mL，進(jìn)行血清敏感性測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的紫外掃描鑒定

由圖2可以看出，BSA吸收峰在278 nm處，與PCM偶聯(lián)后，PCM-BSA吸收峰發(fā)生了改變，吸收峰在277 nm處，初步證明PCM-BSA偶聯(lián)在了一起。

圖2 PCM人工抗原紫外掃描結(jié)果

2.2 人工抗原的凝膠電泳鑒定

SDS-PAGE目的是區(qū)分分子量大小不同的蛋白質(zhì)，分子量大的蛋白質(zhì)移動(dòng)速度慢，分子量小的蛋白質(zhì)移動(dòng)速度快。由圖3可以看出，PCM-BSA在電泳時(shí)移動(dòng)速度比BSA要慢一些，說(shuō)明其分子量比BSA要大一些，進(jìn)一步證明PCM與BSA成功偶聯(lián)在一起。

圖3 PCM人工抗原凝膠電泳結(jié)果

2.3 免疫小鼠血清效價(jià)

由表1可以看出，制備的人工抗原免疫小鼠后，3只小鼠血清均產(chǎn)生抗體針對(duì)PCM-OVA抗體，抗體效價(jià)最高可達(dá)1:6400，說(shuō)明PCM與載體BSA偶聯(lián)在了一起，并且能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。

表1 PCM-BSA免疫小鼠血清效價(jià)(n=2)

2.4 血清敏感性

由表2可以看出，用游離的PCM與包被的PCMOVA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合小鼠血清抗體時(shí)，并沒(méi)有產(chǎn)生明顯的抑制現(xiàn)象，同一小鼠血清、不同濃度PCM的酶標(biāo)板孔的OD450值沒(méi)有出現(xiàn)有序的隨PCM濃度降低而增加的現(xiàn)象，說(shuō)明PCM-BSA免疫小鼠產(chǎn)生的血清雖然與PCMOVA發(fā)生反應(yīng)，但與PCM并不反應(yīng)。這可能是因?yàn)槿斯た乖苽溥^(guò)程中，破壞了PCM的抗原決定簇，導(dǎo)致了PCM-BSA免疫小鼠的血清，可以與PCM-OVA反應(yīng)，但不能識(shí)別PCM。為了證明這種可能性，把制備的PCM-OVA溶液倍比稀釋與酶標(biāo)板上包被的PCMOVA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合小鼠血清，測(cè)定各酶標(biāo)板孔OD450值的變化，結(jié)果見表3。由表3的結(jié)果可以看出，隨著PCMOVA溶液稀釋倍數(shù)的增加，也即隨著PCM-OVA濃度的降低，酶標(biāo)板孔的OD450值逐漸增加，說(shuō)明游離的PCM-OVA能與酶標(biāo)板包被的PCM-OVA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合小鼠血清。

表2 PCM-BSA免疫小鼠血清敏感性(n=2)

表3 PCM-OVA替代PCM測(cè)定小鼠血清敏感性(n=2)

3 討論

PCM分子量為281.14，屬于小分子半抗原物質(zhì)，其只有反應(yīng)原性而缺少免疫原性，也即其本身不能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，必須與載體蛋白如BSA、OVA、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)等偶聯(lián)制備人工抗原，才能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體。不同的小分子半抗原物質(zhì)根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)的不同而采用不同的偶聯(lián)方法，如碳二亞胺法，混合酸苷法，活潑酯法，重氮化法等[25]來(lái)制備其人工完全抗原。從分子結(jié)構(gòu)上看，PCM本身沒(méi)有可以和蛋白質(zhì)氨基或羧基直接相連的位點(diǎn)，因此本研究中對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造，通過(guò)琥珀酸酐法改造在分子結(jié)構(gòu)上引入羧基基團(tuán)，然后分別與載體蛋白BSA，OVA偶聯(lián)在一起，其中PCM-BSA作為人工免疫原來(lái)免疫小鼠產(chǎn)生抗體，而PCM-OVA作為包被原，包被酶標(biāo)板測(cè)定PCM-BSA免疫小鼠的血清效價(jià)及血清敏感性。

有許多方法可以用來(lái)鑒定所制備的小分子半抗原物質(zhì)的人工抗原質(zhì)量，而SDS-PAGE、紫外掃描、動(dòng)物免疫是常用的3種鑒定方法[24,26]。本研究中，紫外掃描結(jié)果表明，PCM-BSA紫外吸收峰與BSA的吸收峰有所不同，初步證明PCM與BSA成功偶聯(lián)在一起。而SDS-PAGE結(jié)果表明，PCM-BSA在膠板上電泳的速度較BSA慢一些，說(shuō)明PCM-BSA分子量比BSA分子量大，也證明PCM與BSA成功偶聯(lián)在一起。但上述這2種方法的結(jié)果只是簡(jiǎn)單證明了PCM偶聯(lián)到載體蛋白BSA分子上，但并不能確定人工抗原的分子構(gòu)象，也不能確定PCM是否正確偶聯(lián)到載體蛋白上，更不能確定人工抗原制備過(guò)程中是否破壞了PCM的抗原決定簇。而一旦PCM抗原決定簇破壞，即使PCM-BSA能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，但抗體也不能與PCM發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)。

小分子半抗原是否正確地與載體蛋白偶聯(lián)且保持抗原決定簇沒(méi)有被破壞，最有效的證明方式就是用制備的小分子的人工抗原免疫動(dòng)物如小鼠、大白兔等，測(cè)定動(dòng)物產(chǎn)生的抗血清是否與小分子產(chǎn)生免疫反應(yīng)[27]。用PCM-BSA免疫小鼠時(shí)，血清中也含有BSA的抗體，但在由于檢測(cè)血清效價(jià)時(shí)，包被在酶標(biāo)板上的人工抗原載體蛋白是OVA，不是BSA，因此可以排除檢測(cè)到的血清抗體是針對(duì)BSA的抗體，說(shuō)明PCM偶聯(lián)到了BSA上，并能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。用PCM作為抑制劑測(cè)定血清的敏感性時(shí)，低濃度的PCM不能阻止血清與包被在酶標(biāo)板上的PCM-OVA反應(yīng)，而PCM-OVA溶液卻能夠有效地阻止血清與包被在酶標(biāo)板上的PCMOVA的結(jié)合，說(shuō)明在制備PCM的人工抗原時(shí)，其抗原決定簇可能被破壞，因此PCM-BSA免疫小鼠的血清在用PCM-OVA包被的酶標(biāo)板檢測(cè)時(shí)顯示有血清效價(jià)，但對(duì)PCM并沒(méi)有敏感性，而對(duì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的PCM有敏感性。我們?cè)谝酝难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，利用玉米赤霉醇制備的人工抗原免疫動(dòng)物時(shí)沒(méi)有得到能夠識(shí)別玉米赤霉醇的抗體，但利用其結(jié)構(gòu)類似物玉米赤霉酮制備人工抗原免疫動(dòng)物得到了能夠識(shí)別玉米赤霉醇的高靈敏度抗體[27]。因此，可以嘗試采用PCM結(jié)構(gòu)類似物制備的人工抗原免疫動(dòng)物，從而制備能夠識(shí)別PCM的抗體。

4 結(jié)論

本研究嘗試通過(guò)琥珀酸改造PCM，并采用碳二亞胺法制備PCM人工抗原。用制備的PCM人工抗原免疫小鼠，盡管免疫小鼠的血清效價(jià)比較高，但血清對(duì)PCM的靈敏度比較低。可能是制備PCM人工抗原過(guò)程中，PCM抗原決定簇被破壞。說(shuō)明本研究采用的制備PCM人工抗原的方法不可行，需要進(jìn)一步探索新的PCM人工抗原制備方法?？梢試L試采用PCM的結(jié)構(gòu)類似物來(lái)制備人工抗原，通過(guò)免疫動(dòng)物，來(lái)制備針對(duì)PCM的抗體。