口蹄疫檢測方法研究進展※

●宿 放 信吉閣 董 俊 楊云慶 葉玲玲 羅倩敏 李瑤瑤 董仙蘭 王修庚 韓佃剛，※※ 艾 軍※※

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南 昆明 650201；2.昆明海關(guān)技術(shù)中心 云南 昆明 650200；3.梁山縣扶貧開發(fā)辦公室 山東 濟寧 272600）

口蹄疫（Foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要感染豬、牛、羊、駱駝等偶蹄動物[1]?？谔阋卟《緦儆谛NA病毒科口蹄疫病毒屬，可通過呼吸道、消化道、生殖道和傷口感染易感動物，通常以直接和間接接觸傳播，也可通過人、蜱、蠅、鳥等動物傳播，在有風(fēng)的情況下還能遠距離傳播。感染動物的唾液、淚液、尿液、糞便、乳汁、精液、肉產(chǎn)品及副產(chǎn)品等均可攜帶病毒[2]。動物感染口蹄疫病毒后幾乎100%發(fā)病[3]，表現(xiàn)為口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發(fā)生水皰性疹，潰爛后可引起部位病變，同時伴隨發(fā)熱、厭食、寒戰(zhàn)、磨牙、流口水、跛行、跺腳或踢腳、泌乳量減少等癥狀，死后剖檢可見“虎斑心”。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）已將其列為必須報告的動物傳染病，我國也將其歸為一類動物疫病[4]。

目前已知口蹄疫在世界范圍內(nèi)有7個主要的血清型：O、A、AsiaⅠ、C、SAT-1、SAT-2和SAT-3型[5]，且各血清型之間無交叉免疫保護反應(yīng)，這就意味著在進行免疫防控時相當(dāng)于面對7種不同的疫病[6]。由于口蹄疫傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行，造成巨大經(jīng)濟損失和社會影響[7]。我國近年來暴發(fā)的口蹄疫主要由O型、A型和AsiaⅠ型病毒引起，嚴重威脅全國各地區(qū)家畜安全和畜產(chǎn)品貿(mào)易[8]。

因此，選擇合適的口蹄疫檢測方法對深入開展我國口蹄疫流行病學(xué)調(diào)查與防控研究均具有重要意義。本文結(jié)合OIE手冊和中國國家標準（GB/T 18935-2018）對目前主要的13種口蹄疫檢測方法進行歸納，以期為實際檢測篩選出最適檢測方法提供參考。

1 檢測抗原

1.1 病毒分離鑒定

1.1.1 細胞培養(yǎng)與病毒分離鑒定病毒分離鑒定是口蹄疫病毒診斷最可靠的辦法，通常使用豚鼠腎、倉鼠腎、豬腎、牛腎、牛舌上皮等原代細胞或傳代細胞，使病毒在細胞內(nèi)增殖，根據(jù)細胞病變效應(yīng)（CPE）來進行分離鑒定。

1.1.2 病毒VP1基因序列分析FMDV蛋白在蛋白酶水解后，裂解為4種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP4）和多種非結(jié)構(gòu)蛋白。VP1蛋白是主要的保護性抗原，由于VP1基因變異最頻繁，因此其抗原性差異是進行FMDV血清型的劃分依據(jù)。獲得的病毒VP1序列后與已公布的序列進行比對分析，便可確定病毒的血清型及其亞型。

李琪等[11]對廣東地區(qū)2015～2016年收集的豬病料提取RNA，進行反轉(zhuǎn)錄后利用O、A和AsiaⅠ型的通用引物進行擴增，克隆測序后將測序結(jié)果利用分析軟件進行比對，分析確認了其中有11株O型FMDV屬于耿馬譜系且發(fā)生了變異。石慶偉等[12]同樣利用對VP1基因序列分析的方法，確定了從廣東采集5份疑似FMDV感染病料中的2份為O型FMDV感染，3份為A型FMDV感染。整個過程比較繁瑣，結(jié)果可靠性較病毒分離試驗差，但只要確?？寺『骎P1序列的完整性，也可得到一個較可靠的結(jié)果。

1.2 病毒核酸檢測

1.2.1 實時熒光定量PCR通過將FMDV各血清型全基因組序列進行比對，可針對不同血清型差異較大的結(jié)構(gòu)蛋白基因設(shè)計不同的引物，再根據(jù)熒光素的發(fā)光原理，利用TaqMan等技術(shù)，通過PCR擴增進行血清型鑒別診斷。

實時熒光定量PCR是一種常用的檢測病毒樣本的方法，結(jié)果可直接通過熒光PCR儀進行檢測。李世芳等[13]用口蹄疫病毒MYA/98株對3～4日齡的乳鼠進行攻毒，用實時熒光定量PCR檢測攻毒后0、5、10、15 h腸道組織中IFN-ε相對表達量的變化，為Ⅰ型干擾素的不同亞型在抗口蹄疫病毒感染過程中的作用提供了實驗數(shù)據(jù)。蔡順萍等[14]利用實時熒光定量PCR方法用3種口蹄疫試劑盒檢測了O型抗原并進行各項指標的比對，為實驗室選擇試劑盒提供依據(jù)。

1.2.2 多重?zé)晒舛縋CR多重?zé)晒舛縋CR在熒光定量PCR的基礎(chǔ)上，通過設(shè)計多個探針和引物，可在一次PCR反應(yīng)中同時對多個模板進行定量檢測。

吳紹強等[15]利用多重?zé)晒舛縋CR法研發(fā)出的口蹄疫病毒試劑盒，可同時檢測O、A和AsiaⅠ型的口蹄疫病毒。多重PCR檢測方法可同時檢測同種病毒的不同血清型，也可以用于不同病毒的同時檢測。宋爽等[16]根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒的5′ UTR基因、牛傳染性支氣管炎病毒的gB基因和口蹄疫病毒的3D基因建立了特異性強、靈敏度高的多重?zé)晒舛縋CR的方法，可同時快速鑒別檢測這3種病毒。

1.2.3 定型RT-PCR定型RT-PCR同其他PCR方法一樣，避免了病毒分離培養(yǎng)的危險性和基因序列分析的繁瑣性。與多重PCR方法類似，能同時檢測幾種不同的血清型，李金海等[17]根據(jù)我國主要流行的3種血清型及其主要亞型設(shè)計了2對引物（FW1/FW2、FN1/FN2），建立了能夠同時特異性檢測O型、A型及AsiaⅠ型FMDV VP1全基因的RT-nPCR方法，并結(jié)合測序技術(shù)，能對檢測樣本進行準確定型，且靈敏度高，特異性強。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（RT-LAMP）作為一種新穎的恒溫核酸擴增方法，可在65℃恒溫條件下完成擴增反應(yīng)，不需要熱變性、電泳和紫外觀察等過程，擴增產(chǎn)物可通過熒光定量PCR儀檢測熒光強度或通過沉淀反應(yīng)濁度儀檢測焦磷酸鎂的沉淀濁度來進行定量分析，也可通過肉眼觀察顏色變化進行定性分析，在實驗室可用該方法替代PCR方法做初步檢測。

袁彩虹[18]根據(jù)O、A和AsiaⅠ型3種血清型FMDV全基因組序列建立了一種FMDV通用型RT-LAMP快速檢測方法。李健等[19]以FMDV多聚蛋白基因建立了FMDV的RT-LAMP。與PCR方法相比該方法更快速，整個擴增過程大約在1 h內(nèi)完成，可直接用肉眼觀察結(jié)果。該檢測體系具有極高的特異性，與其他類似病毒如豬細小病毒、豬水泡病病毒、豬瘟病毒等無交叉反應(yīng)，比普通PCR和熒光PCR的靈敏性高。謝佳芮等[20]根據(jù)口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型的3D基因序列，設(shè)計17套環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物，建立了免開蓋可視化判定檢測結(jié)果的FMDV群特異性RT-LAMP技術(shù)。免開蓋是指避免空氣中氣溶膠的污染影響肉眼觀察到的結(jié)果。

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1.2.5 基因芯片技術(shù)基因芯片又稱DNA微陣列，結(jié)合了基因探針和雜交測序技術(shù)，通過檢測芯片上的雜交信號強度及分布來進行分析，具有高通量、高集成、微型化和自動化的特點。

作為較新的檢測技術(shù)，近年來基因芯片被廣泛應(yīng)用與優(yōu)化，更高效、更穩(wěn)定。魏春霞等[21]根據(jù)已知的7種牛易感病原核酸序列，利用多重PCR方法，通過肉眼觀察芯片顯色程度后，對芯片技術(shù)進行優(yōu)化，建立了具有高通量、高靈敏度、高特異性等特點的基因芯片檢測方法。該方法可在3 h內(nèi)同時檢測牛7種病原（Bru、MTB、Anthrax、FMDV、BVDV、BPIV3和IBRV）間無交叉反應(yīng)，所有芯片可重復(fù)使用，且芯片在2～8℃條件下能保存半年以上，可滿足一般實驗室的樣品檢測及流行病學(xué)監(jiān)查，同時重復(fù)使用也可降低成本。劉志鵬等[22]建立了可鑒定和區(qū)分口蹄疫病毒 O、A和AsiaⅠ型3種血清型的分型芯片，靈敏度比常規(guī)PCR高10～100倍，特異性也較高，芯片可重復(fù)使用，保存3個月以上。

2 檢測抗體

2.1 間接ELISA

間接ELISA是實驗室最常用的抗體檢測方法之一，間接ELISA應(yīng)用于各種病毒的檢測，其原理是通過利用酶標二抗去辨識一抗來測定抗原量。各類ELISA方法均避免了病毒分離試驗的危險性，也避免如PCR試驗等無菌環(huán)境的限約。

前期研究中有對口蹄疫病毒的檢測和疫苗的研制的相關(guān)實驗。宋妮[23]利用原核表達后純化的SUMO-VP0、SUMO-VP1、SUMO-VP3及VP3蛋白建立了間接ELISA方法，為O型口蹄疫診斷試劑及基因工程亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。王云龍等[24]將O型口蹄疫病毒VP1基因在表達載體pET-41b中表達，最終建立了O型口蹄疫病毒的檢測方法。

2.2 競爭ELISA

競爭ELISA也是常用的抗體檢測方法之一，其原理是將抗體固定于載體表面，一組加入酶標抗原和待測抗原混合液，另一組只加酶標抗原，通過兩組底物降解量之差來測定待測抗原的含量。

楊志元等[25-26]以經(jīng)原核表達、純化及組裝制備的O型FMDV病毒樣顆粒為診斷抗原，HRPIgG為競爭性酶標抗體成功建立用于O型FMDV抗體檢測的競爭ELISA方法，可實現(xiàn)大批量樣品的快速檢測。同時驗證了優(yōu)化后的檢測方法，改良了傳統(tǒng)的競爭ELISA檢測方法，因洗滌次數(shù)過多，影響樣品的檢出速率的缺點[27]。

2.3 病毒中和試驗（VNT）

VNT是檢測FMD的黃金標準，是最權(quán)威、最經(jīng)典的方法，常作為其他方法的參照。VNT是利用血清中和抗體與病毒的特異性中和作用為原理建立的。

廖德芳等[28]利用VNT來評價建立的口蹄疫固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（SPC-ELISA）方法與液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗（LPB-ELISA）之間的差別，對采集的不同物種共94份血清樣品分別進行O型口蹄疫病毒SPC-ELISA、LPB-ELISA和VNT檢測，并分別比較了3種方法的符合率和陽性檢出率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPC-ELISA比LPBELISA更符合VNT的結(jié)果。

2.4 液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗（LPB-ELISA）

由于其精確性、穩(wěn)定性高于正向間接血凝試驗（PHA），且重復(fù)性優(yōu)于VNT，因此液相阻斷ELISA技術(shù)成為國際較為認可的一種標準化診斷技術(shù)，我國目前也將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于口蹄疫流行病學(xué)調(diào)查和免疫[29-30]。王世杰等[31]對該方法進行了改良，利用單一的血清稀釋倍數(shù)來替代繁復(fù)的倍比稀釋，使LPB-ELISA的檢測通量提高了5倍左右。

2.5 固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（SPC-ELISA）

該方法的基本原理是被檢血清中的FMD抗體與定量的FMD豚鼠抗體血清競爭，勝者與固相載體表面的抗原結(jié)合。被檢血清中FMD抗體量越多，結(jié)合在固相載體表面的豚鼠抗體越少，顯色后顏色就越淺。

在常規(guī)檢測中，SPC-ELISA可用來替代VNT，通過對該方法不斷地優(yōu)化，使其檢測結(jié)果更接近于VNT的檢測結(jié)果。謝慶閣[32]詳細介紹了SPC-ELISA的操作步驟；李敏杰等[33]以單抗3D9為捕獲抗體，以HRP標記的單抗9A9作為檢測抗體，建立了基于單抗的A型口蹄疫抗體SPC-ELISA檢測方法；許智強等[34]以單抗3D9為捕獲抗體，以HRP標記的單抗8E8作為檢測抗體，建立了優(yōu)化的固相ELISA檢測方法，此方法有較高敏感性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和特異性。與VNT和LPB-ELISA的相關(guān)性和符合率均較高，批內(nèi)和批間差異性小[35-36]。

2.6 非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗（3ABC-ELISA）

FMDV的非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）與病毒的復(fù)制和裝配相關(guān)。非結(jié)構(gòu)蛋白抗體試驗用于區(qū)分人工免疫的動物和感染野毒的動物。其鑒別診斷的依據(jù)是：滅活疫苗免疫動物后，動物體內(nèi)不會有病毒增殖，也就沒有病毒特異性NSP表達。而感染野毒的動物體內(nèi)則有病毒增殖，病毒刺激動物機體產(chǎn)生了相應(yīng)的NSP抗體。因此，可通過檢測動物體內(nèi)是否產(chǎn)生NSP抗體來區(qū)分感染野毒的動物與人工接種疫苗的動物[37]。該方法在最新的國家標準中替代了抗原瓊脂凝膠免疫擴散試驗（VIAAGID）。

王玉玲等[38]利用150份牛血清對國內(nèi)外3種口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測方法和1種口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體阻斷ELISA檢測方法進行比較，結(jié)果表明該方法敏感性達到100%，特異性也接近100%，說明該方法具有很高的敏感性和特異性，可用于口蹄疫病毒感染與疫苗免疫抗體的鑒別診斷。

3 FMDV的檢測方法的優(yōu)缺點

文中列舉的13種檢測FMDV的方法具有不同的優(yōu)缺點，詳見表1。

表1 13種FMDV檢測方法比較

綜上，可以根據(jù)具體檢測條件和檢測要求來選擇合適的檢測方法，得到更準確的檢測結(jié)果，方便高效地開展口蹄疫流行病學(xué)調(diào)查和疫病防控。