冷凍切片組織速凍方法改良

陳 志，朱衛(wèi)東，郭凌川

冷凍切片制作是將新鮮的病變組織與OCT包埋劑在低溫環(huán)境下快速冷凍后切成薄片的過程。冷凍切片制作流程簡便、迅速，有助于外科醫(yī)師判斷病變的良惡性，及時決定手術(shù)方式。準(zhǔn)確的病理診斷結(jié)果依賴優(yōu)質(zhì)、高效的冷凍切片制作，影響冷凍切片質(zhì)量的因素較多，如取材、溫度、切片、染色等，而冷凍時間是影響制片優(yōu)劣的重要因素之一[1]。本實驗通過比較兩種不同冷凍方法的制片速度和質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)一種方便易行的組織速凍方法，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)室送檢的行術(shù)中快速冷凍病理檢查標(biāo)本50例，其中乳腺8例，肺12例，甲狀腺12例，子宮肌瘤10例，前哨淋巴結(jié)8例。

1.2 儀器與試劑ThermoFisherNX50冷凍切片機，Olympus BX31光學(xué)顯微鏡，95%乙醇固定液，Gill蘇木精，0.25%醇溶性伊紅，無水乙醇，中性樹膠等。

1.3 方法將50例標(biāo)本平均分為2組，每組含乳腺4例，肺6例，甲狀腺6例，子宮肌瘤5例，前哨淋巴結(jié)4例。采用兩種方法制片：(1)冷凍臺冷凍法：將組織放入組織托上添加適量的OCT包埋劑，置于冷凍切片機冷凍臺上進行冷凍。(2)改良冷凍法：將組織放入組織托，加入OCT包埋劑。在冷凍切片機冷凍臺凹槽里加少許無水乙醇，使其鋪滿凹槽底部，再將組織托放入冷凍凹槽進行速凍。組織冷凍后行常規(guī)冷凍切片、HE染色、中性樹膠封固。

1.4 結(jié)果判定HE切片根據(jù)切片完整度、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、染色強度、染色對比度、有無空泡、冰晶、裂隙等因素進行評分。冷凍切片質(zhì)量評分等級標(biāo)準(zhǔn)：滿分為100分，90分以上為甲級片，80～89分為乙級片，60～79分為丙級片，60分以下為丁級片。所有切片均經(jīng)兩位主治醫(yī)師獨立判斷評分。

2 結(jié)果

2.1 兩種冷凍方法的冷凍時間對比冷凍時間以組織托放入冷凍槽內(nèi)開始計時，以組織及周圍OCT包埋劑完全凝固為結(jié)束時間，分別記錄每個組織樣本的冷凍時間。單因素方差分析的方差齊性檢驗表明本組實驗不適用于單因素方差分析，遂改用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗，結(jié)果表明改良冷凍法的組織冷凍時間明顯低于冷凍臺冷凍法，差異有顯著性(P<0.001，表1)。

表1 兩種冷凍方法的組織冷凍時間

2.2 兩種冷凍方法的制片質(zhì)量對比將所有切片評分后根據(jù)組織類型分類，比較兩種方法的區(qū)別。單因素方差分析結(jié)果表明，改良冷凍法處理乳腺、肺、甲狀腺、子宮肌瘤、前哨淋巴結(jié)的得分均高于冷凍臺冷凍法，差異有顯著性(P均<0.05，表2)。

表2 兩種冷凍方法的制片質(zhì)量評分

鏡下觀察兩種方法制片行HE染色后冰晶出現(xiàn)情況，鏡下發(fā)現(xiàn)經(jīng)冷凍臺冷凍法處理的組織內(nèi)形成大量冰晶，細(xì)胞核受擠壓，有空洞，細(xì)胞間有不規(guī)則裂隙，組織結(jié)構(gòu)形態(tài)變化明顯；經(jīng)改良冷凍法處理的組織中冰晶較少，組織結(jié)構(gòu)完整，無空洞、裂隙，染色均勻(圖1、2)。

圖1 冷凍臺冷凍法：A.甲狀腺；B.子宮肌瘤；C.前哨淋巴結(jié) 圖2 改良冷凍法：A.甲狀腺；B.子宮肌瘤；C.前哨淋巴結(jié)

2.3 兩種冷凍方法的報告時間對比記錄每個標(biāo)本從接受到報告簽發(fā)的時間。改良冷凍法的平均報告時間為21.3 min，冷凍臺冷凍法的平均報告時間為33.6 min。冷凍臺冷凍法的報告超時率為40%(10/25)，改良冷凍法的報告超時率為4%(1/25)。Wilcoxon秩和檢驗結(jié)果分析顯示，改良冷凍法的平均報告時間明顯低于冷凍臺冷凍法，差異有顯著性(P<0.001，表3)。

表3 兩種冷凍方法的報告時間

3 討論

冷凍速度是冷凍切片成敗的關(guān)鍵。冷凍速度慢、時間長導(dǎo)致組織內(nèi)產(chǎn)生大量冰晶[2]。組織在緩慢冷凍的過程中細(xì)胞內(nèi)外的水分子逐漸凝結(jié)，形成較大的冰晶顆粒，從而擠壓細(xì)胞核或使細(xì)胞間隙增大，待切片染色時冰晶融化留下大量的空泡、空核，組織形態(tài)上也會出現(xiàn)間隙增大，組織結(jié)構(gòu)改變等假象，嚴(yán)重影響病理診斷的準(zhǔn)確性[3]。

在較短的時間內(nèi)達(dá)到組織所需的冷凍溫度，是減少冰晶生成的有效方法[4]。傳統(tǒng)的冷凍臺冷凍法利用組織托的傳導(dǎo)性將低溫從冷凍臺傳導(dǎo)到組織上，與以下因素有關(guān)：(1)組織托與冷凍臺并非完全貼合。(2)低溫傳導(dǎo)方向自下而上，越往組織表面?zhèn)鲗?dǎo)速度越慢。改良冷凍法在組織托和冷凍臺凹槽之間加入無水乙醇作為傳導(dǎo)媒介，增大了組織托與冷凍臺的接觸面積。此外，無水乙醇的冰點為-114 ℃，低溫下不會凝結(jié)且有良好的冷傳導(dǎo)效率，因而能加速組織的冷凍，明顯縮短冷凍時間，最大程度的減少冰晶的產(chǎn)生。在組織底部基本凝固，表面少許OCT尚未凝固時，可放置冷凍錘于組織表面，加速表面組織的冷凍，進一步縮短冷凍時間[5]。另外，取材時應(yīng)避免用水沖洗標(biāo)本，組織血水較多時需用紗布吸去表面的水分，也可減少冰晶的產(chǎn)生。

綜上所述，改良冷凍法可以有效地減少冰晶的產(chǎn)生，值得臨床應(yīng)用和推廣。制作出高質(zhì)量的冷凍切片是病理技術(shù)人員不斷追求的目標(biāo)。一張高質(zhì)量的冷凍切片除考慮冷凍時間外還需考慮多方面因素，如取材大小、厚度、切片技術(shù)、染色流程等[6]。只有在工作中不斷地探索、學(xué)習(xí)、改進，才能使技術(shù)水平不斷地提高。