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    EGFL6在胃癌血管生成中的作用

    2021-12-13 05:15:28慧,談
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞株計(jì)數(shù)胃癌

    門 慧,談 順

    胃癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的重要原因。探討胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子機(jī)制從而尋求有效的治療手段是現(xiàn)階段研究的重要任務(wù)[1-2]。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴以生存的土壤,腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移需要新生血管支持,而血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管形成的基礎(chǔ)[3]。EGFL6屬于EGF重復(fù)超級(jí)家族,是一種分泌蛋白,特征是EGF結(jié)構(gòu)域重復(fù),由于同時(shí)具有EGF結(jié)構(gòu)域和MAM結(jié)構(gòu)域,又被命名為MAEG,參與細(xì)胞周期、增殖及發(fā)育調(diào)節(jié)[4]。文獻(xiàn)報(bào)道,EGFL6在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào),并促進(jìn)腫瘤血管形成:如EGFL6促進(jìn)乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移及血管形成[5];EGFL6能促進(jìn)卵巢癌[6]、結(jié)直腸癌[7-9]侵襲、轉(zhuǎn)移;EGFL6在黑色素瘤[10-11]、鼻咽癌[12]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[13]、肺腺癌[14]中高表達(dá);EGFL6促進(jìn)斑馬魚(yú)胚胎血管形成[15]。迄今為止,EGFL6在胃癌微環(huán)境中的生物學(xué)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本文著重探討EGFL6在胃癌血管生成中的作用,為臨床腫瘤治療提供新的分子治療靶點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞、試劑與儀器細(xì)胞株、胃癌組織均來(lái)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬??卺t(yī)院,RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自BI生物公司,0.25%胰酶購(gòu)自Life公司,EGFL6多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司,CD34抗體購(gòu)自福州邁新公司,過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自廣州銳博公司,慢病毒上清自提,SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Bioword公司,5×SDS蛋白上樣緩沖液、ECL化學(xué)發(fā)光液、全蛋白提取試劑盒購(gòu)自凱基生物公司,電泳儀購(gòu)自BAYGENE公司,低溫高速離心機(jī)購(gòu)自Thermo公司,蛋白濃度的酶標(biāo)儀購(gòu)自BIO-BRAD公司,分光光度計(jì)及低溫離心機(jī)購(gòu)自Thermo公司。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑購(gòu)自TaKaRa公司,β-actin單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司。

    1.2 方法

    1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞株及人類血管內(nèi)皮細(xì)胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),選擇狀態(tài)佳的細(xì)胞株用于實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2EGFL6過(guò)表達(dá)穩(wěn)定株構(gòu)建 提前48 h鋪工具細(xì)胞293T于75 cm2培養(yǎng)瓶中,至細(xì)胞融合度達(dá)70%左右,細(xì)胞液換成無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基,取2.5 μg EGFL6質(zhì)粒、5 μL HIV包裝質(zhì)粒混合液于1.5 mL無(wú)菌EP管,加入Opti-Mem液至200 μL;加入15 μL EndoFection轉(zhuǎn)染試劑于1.5 mL無(wú)菌EP管,加入Opti-Mem至200 μL,將本次200 μL混合液加入前一支1.5 mL EP管,混勻,靜置20 min。然后再把混合液加入293T細(xì)胞中,再加入1/500總體積的Titerboost增強(qiáng)劑。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h,用含5%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基換液(內(nèi)含有雙抗1 ∶100比例配置),繼續(xù)培養(yǎng)48 h,取病毒上清,離心、過(guò)濾,-80 ℃保存。前一天鋪MGC803細(xì)胞于6孔板中,至細(xì)胞融合度約70%,用已收集好的病毒上清換液,每孔1 mL,繼續(xù)培養(yǎng)36 h,用含5%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基換液(內(nèi)含有雙抗1 ∶100比例配置),培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿,用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基藥篩,最后擴(kuò)大培養(yǎng)。

    1.2.3RT-PCR (1)細(xì)胞及組織總RNA提?。杭?xì)胞生長(zhǎng)鋪滿瓶底,PBS洗3次,每10 cm2瓶壁面積加入1 mL Trizol試劑,于冰上裂解5 min,0.2 mL氯仿/1 mL Trizol比例加入氯仿,混勻冰上置2~3 min,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,上層水相轉(zhuǎn)移至去酶1.5 mL離心管,沉淀RNA中加入等體積異丙醇,室溫靜置10 min,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,除上清,收沉淀,DEPC處理過(guò)的水配制75%乙醇洗滌,離心,室溫放置自然干燥,DEPC水溶解RNA,測(cè)RNA濃度。組織總RNA提?。貉欣徬磧糁?80 ℃烤箱烘烤5 h,冷卻備用,研缽中加入適量的液氮,將組織剪約綠豆大小研磨成粉末狀,加入Trizol 1 mL勻漿裂解,裂解物移至DEPC水處理過(guò)的1.5 mL微離心管中,余步驟同前。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)試劑配制反應(yīng)體系,37 ℃反應(yīng)15 min,85 ℃滅活5 min,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DEPC水稀釋約4倍,-20 ℃保存,備用。(3)RT-PCR反應(yīng):EGFL6引物序列:上游5′-AG GCATCACGGGTTGTTAGC-3′;下游5′-CGTAGCAG CAGGCCAGTTTAG-3′,根據(jù)TaKaRa RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系,95 ℃預(yù)變性10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃約30 s、72 ℃ 34 s,合計(jì)40個(gè)循環(huán)。7500 Fast Real-time PCR儀取得各模板Ct值,以Folds=2-ΔΔCt代表實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組目的基因表達(dá)關(guān)系。

    1.2.4Western blot法 (1)蛋白濃度測(cè)定-BCA法:采用Bioworld公司BCA Protein Assay Reagengt Kit進(jìn)行檢測(cè)。酶標(biāo)儀器測(cè)量570 nm處吸光度值(OD值),測(cè)量蛋白濃度。(2)Western blot:配制10%SDS-PAGE分離膠、5%SDS-PAGE濃縮膠,每個(gè)泳道上樣量40 μg,進(jìn)行電泳。根據(jù)蛋白Marker位置切目的條帶,Bio-Rad微型電轉(zhuǎn)系統(tǒng),200 mA電流,冰上轉(zhuǎn)膜,條帶封閉(含約5%脫脂奶粉或血清的PBST)1 h,加入一抗,4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗膜,加入HRP標(biāo)記抗兔二抗,室溫孵育約1 h,PBST洗膜。于化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行發(fā)光。

    1.2.5條件培養(yǎng)基的制備 胃癌細(xì)胞株置于75 cm2的培養(yǎng)瓶,長(zhǎng)滿至瓶底面積80%~90%,PBS洗2次,改用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,吸取細(xì)胞培養(yǎng)液至無(wú)菌離心管,離心、棄沉淀,取上清,置于-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.6雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn) 取6~7日齡的雞胚,在超凈臺(tái)內(nèi)用有齒小鑷鈍頭在氣室中心敲開(kāi)一個(gè)直徑約1 cm小洞,將直徑約0.8 cm無(wú)菌的橡膠圈放入已暴露好的雞胚尿囊膜表面,條件培養(yǎng)基約200 μL加入橡膠圈中,醫(yī)用膠白布封口,置于37 ℃、80%濕度的孵箱內(nèi)孵育48~72 h。取出處理好的雞胚,將丙酮與甲醇混合液(1 ∶1比例配置)滴入尿囊膜表面,固定15 min,尿囊膜輕輕剪下來(lái),生理鹽水浸泡,撈片、攤片,拍照。

    1.2.7小管形成實(shí)驗(yàn) 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC饑餓過(guò)夜,將Matrigel基質(zhì)膠鋪于24孔板,每孔200 μL,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱30 min,每孔鋪2×104個(gè)HUVEC細(xì)胞于基質(zhì)膠上并加入200 μL條件培養(yǎng)基,于37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育12 h,鏡下觀察小管形成情況。

    1.2.8Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC饑餓過(guò)夜,將600~800 μL條件培養(yǎng)基加入24孔板下室中,上室加約200 μL細(xì)胞懸液,每個(gè)小室加入2×105個(gè)細(xì)胞,置37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)約12 h。取出小室,用PBS液沖洗小室3次,經(jīng)10%中性福爾馬林固定,蘇木精染色。顯微鏡下觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù),取上、下、左、右、中5個(gè)視野,計(jì)數(shù)穿過(guò)膜細(xì)胞數(shù)。

    1.2.9免疫組化 采用免疫組化SP法染色。具體步驟:烤片、脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、山羊血清工作液封閉、一抗4 ℃冰箱孵育過(guò)夜、生物素標(biāo)記二抗、辣根過(guò)氧化物酶孵育、DAB顯色、蘇木精染色、脫水、透明、干燥、封固定。判斷標(biāo)準(zhǔn)[16]:(1)按細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分:未著色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕褐色為3分;(2)按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分:≤5%為0分,6%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%為4分;將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加:3~4分為低表達(dá),5~7分為高表達(dá)。微血管密度(microvessel density, MVD)計(jì)數(shù)[16-18]:取3個(gè)腫瘤血管密度最高的熱點(diǎn)區(qū)(100×),在這3個(gè)熱點(diǎn)區(qū)隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野微血管數(shù)目(200×),取5個(gè)視野微血管數(shù)目均值為本例的MVD(微血管是指管腔直徑約>8個(gè)紅細(xì)胞直徑的總和)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組均數(shù)間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),生存率的比較采用Mantel-Cox檢驗(yàn),取α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

    2 結(jié)果

    2.1 胃癌組織中EGFL6 mRNA的表達(dá)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)40例配對(duì)新鮮胃癌組織中EGFL6 mRNA表達(dá),與周圍正常胃黏膜組織比較,胃癌組織中EGFL6 mRNA高表達(dá)31例,低表達(dá)9例。結(jié)果顯示與周圍正常胃黏膜組織相比,胃癌組織中EGFL6 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05,圖1)。

    圖1 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)40例新鮮配對(duì)胃癌組織中EGFL6 mRNA的表達(dá)水平:

    2.2 EGFL6表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性利用Kaplan-Meier生存曲線分析EGFL6表達(dá)與胃癌患者5年生存時(shí)間的關(guān)系,31例高表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間為36個(gè)月,9例低表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間為48個(gè)月。EGFL6高表達(dá)患者5年生存率明顯低于EGFL6低表達(dá)患者(P<0.05,圖2)。

    圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析EGFL6表達(dá)與胃癌患者5年生存率的關(guān)系

    2.3 胃癌組織中EGFL6的表達(dá)與腫瘤MVD計(jì)數(shù)的關(guān)系免疫組化結(jié)果顯示,在胃癌組織中EGFL6高表達(dá)39例,低表達(dá)11例,高表達(dá)組MVD計(jì)數(shù)平均為(36.46±0.71)個(gè)/HPF,低表達(dá)組MVD計(jì)數(shù)平均為(16.64±0.92)個(gè)/HPF(圖3A~D);EGFL6高表達(dá)組的MVD計(jì)數(shù)明顯高于低表達(dá)組(P<0.05,圖3E)。

    圖3 A.EGFL6在胃癌組織中高表達(dá);B.EGFL6高表達(dá)胃癌組織中的MVD;C.EGFL6在胃癌組織中低表達(dá);D.EGFL6低表達(dá)胃癌組織中的MVD;E.EGFL6高表達(dá)組與低表達(dá)組MVD計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖

    2.4 Western blot法及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞株中EGFL6內(nèi)源性表達(dá)Western blot法及RT-PCR檢測(cè)3株胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823、MGC803中EGFL6的表達(dá)水平,結(jié)果顯示EGFL6在MGC803細(xì)胞中表達(dá)水平最低(圖4)。

    圖4 A.Western blot法檢測(cè)3株胃癌細(xì)胞株中EGFL6蛋白表達(dá);B.RT-PCR技術(shù)檢測(cè)3株胃癌細(xì)胞株中EGFL6 mRNA表達(dá)

    2.5 Western blot法及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)慢病毒感染效率Western blot法及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)EGFL6慢病毒過(guò)表達(dá)載體感染MGC803細(xì)胞后EGFL6水平,結(jié)果顯示:MGC803/MOCK組及MGC803/EGFL6組帶有綠色熒光的病毒載體成功轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞株中(圖5A);與MGC803/MOCK組相比,MGC803/EGFL6組EGFL6的蛋白及mRNA水平均明顯上調(diào)(圖5B、C),兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    圖5 A.熒光顯微鏡檢測(cè)目的病毒載體成功轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞株中;B.Western blot法檢測(cè)MGC803/EGFL6穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建效率;C.RT-PCR技術(shù)檢測(cè)MGC803/EGFL6穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建效率

    2.6 Western blot法檢測(cè)條件培養(yǎng)基中EGFL6蛋白表達(dá)Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,與MGC803/MOCK組相比,MGC803/EGFL6組蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖6)。

    圖6 Western blot法檢測(cè)條件培養(yǎng)基中EGFL6蛋白表達(dá)

    2.7 血管形成實(shí)驗(yàn)雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)、小管形成實(shí)驗(yàn)及內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察EGFL6促進(jìn)體內(nèi)、外血管形成情況,與MGC803/MOCK組相比,MGC803/EGFL6組體內(nèi)、外血管形成能力明顯增加(圖7),兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);提示EGFL6能夠促進(jìn)體內(nèi)、外血管形成能力。

    圖7 A.雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)觀察體內(nèi)血管形成能力;B.小管形成實(shí)驗(yàn)觀察體外血管形成能力;C.內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察體外血管形成能力;D.內(nèi)皮細(xì)胞穿過(guò)小室膜數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖

    3 討論

    胃癌是全球發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一。由于其復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率均較高,患者預(yù)后較差。腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多階段復(fù)雜的病理過(guò)程,需要多種基因相互調(diào)控協(xié)助工作,腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移需要新生血管的形成,為其提供各種細(xì)胞因子及營(yíng)養(yǎng)成分。生理情況下,機(jī)體僅在需要時(shí)才會(huì)有新生血管形成,而在腫瘤發(fā)生、發(fā)展時(shí)這種平衡狀態(tài)

    會(huì)被打破,最終使得腫瘤內(nèi)血管不斷形成。目前胃癌的治療在手術(shù)、放化療等方面取得了較大進(jìn)展,但生存率結(jié)果依然不容樂(lè)觀,而抗腫瘤血管生成治療在胃癌治療中起重要作用[19-23]。

    EGFL6蛋白是EGF重復(fù)超級(jí)家族中的一員,其特征是EGF結(jié)構(gòu)域重復(fù),由于同時(shí)具有EGF結(jié)構(gòu)域和MAM結(jié)構(gòu)域,又被命名為MAEG,參與細(xì)胞周期、增殖及發(fā)育調(diào)節(jié),由于包括了1個(gè)N端信號(hào)肽,所以是一種分泌蛋白。EGFL6與乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、結(jié)直腸癌、鼻咽癌等腫瘤均密切相關(guān),EGFL6促進(jìn)乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移及血管形成,EGFL6通過(guò)p-ERK促進(jìn)骨微環(huán)境血管生成從而促進(jìn)骨質(zhì)愈合[24],EGFL6促進(jìn)斑馬魚(yú)胚胎血管形成,同家族成員EGFL7可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及血管形成,促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤及腎細(xì)胞癌血管形成[25-27],EGFL6在胃癌微環(huán)境中的作用至今尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

    本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的EGFL6 mRNA表達(dá)水平上調(diào),Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,EGFL6表達(dá)與胃癌患者5年生存率呈負(fù)相關(guān)。采用免疫組化法檢測(cè)胃癌組織中EGFL6蛋白表達(dá),并利用CD34計(jì)數(shù)MVD,結(jié)果顯示高表達(dá)EGFL6組MVD計(jì)數(shù)明顯增多,說(shuō)明EGFL6有促進(jìn)胃癌組織血管形成的趨勢(shì)。為了驗(yàn)證這一現(xiàn)象,本實(shí)驗(yàn)采用血管形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析,選取內(nèi)源性表達(dá)較低的胃癌細(xì)胞株MGC803進(jìn)行EGFL6慢病毒過(guò)表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建,RT-PCR及Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。收集過(guò)表達(dá)MGC803/EGFL6胃癌細(xì)胞株條件培養(yǎng)基,Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,條件培養(yǎng)基制備成功。利用血管形成實(shí)驗(yàn)(雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)、小管形成實(shí)驗(yàn)及內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn))檢測(cè)胃癌組織中血管生成情況,結(jié)果顯示EGFL6促進(jìn)胃癌血管形成。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,EFGL6在胃癌中高表達(dá),與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān),并能促進(jìn)胃癌血管形成,但EGFL6在胃癌組織中促進(jìn)血管形成具體作用機(jī)制及信號(hào)通路仍不清楚,有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)深入探究。EGFL6有望成為腫瘤標(biāo)志物的篩查指標(biāo),為臨床腫瘤診治及新藥研究提供新的靶點(diǎn)依據(jù),更好的服務(wù)于患者。

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