分子生物學(xué)技術(shù)在植物病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

董芳娟 魏增云 薄一覽

(忻州師范學(xué)院，山西 忻州 034000)

植物病毒在全球范圍內(nèi)的危害越來越大，植物病毒能夠?qū)е罗r(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物發(fā)病，造成產(chǎn)量下降甚至絕收的情況出現(xiàn)，給農(nóng)業(yè)帶來極大的損失。近年來，發(fā)現(xiàn)的植物病毒種類越來越多，當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的植物病毒分為18個(gè)科，共76個(gè)屬，總數(shù)量超過1000種。隨著我國(guó)與國(guó)際貿(mào)易規(guī)模不斷擴(kuò)大，境外植物病毒通過口岸的輸出風(fēng)險(xiǎn)不斷擴(kuò)大，因此加強(qiáng)植物病毒的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性就顯得更為重要。為了防止植物病毒的危害，需要做好病毒預(yù)防和綜合防治工作，而建立快速、高靈敏度、高通量的病毒檢測(cè)體系是做好上述工作的前提。植物病毒的檢測(cè)技術(shù)經(jīng)歷了多年發(fā)展，起初常用的檢測(cè)技術(shù)包括生物學(xué)鑒定和電子顯微鏡技術(shù)，隨后酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)成為植物病毒常用的手段。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在植物病毒檢測(cè)領(lǐng)域，分子生物學(xué)方法已經(jīng)獲得了廣泛的應(yīng)用，包括核酸雜交技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)和DNA微陣列技術(shù)等，本文對(duì)這幾種技術(shù)及其在植物病毒檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

1 核酸雜交技術(shù)

根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，互補(bǔ)的核酸單鏈可以相互結(jié)合，核酸雜交技術(shù)就是利用了這一原理，通過對(duì)一段病毒特異的核酸序列進(jìn)行標(biāo)記，制成探針，將其和待測(cè)樣品的核酸進(jìn)行雜交，若發(fā)生雜交則表示病毒存在。這種方法可以應(yīng)用于DNA、RNA病毒及類病毒的檢測(cè)，該方法具有較高的靈敏度，同時(shí)還具有特異性強(qiáng)、通量高等方面的優(yōu)點(diǎn)。在實(shí)際應(yīng)用中，為了滿足病毒檢測(cè)的實(shí)際需求，既可以制備用于單一病毒檢測(cè)的單特異性探針，也可以制備用于多種病毒檢測(cè)的復(fù)合型探針。當(dāng)前核酸雜交技術(shù)在植物病毒檢測(cè)領(lǐng)域已經(jīng)獲得了廣泛應(yīng)用，包括核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)、核酸狹縫印跡雜交技術(shù)和Northem印跡等技術(shù)，在植物病毒檢測(cè)方面都有重要應(yīng)用。研究人員對(duì)核酸雜交技術(shù)在植物病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究，Brown等對(duì)核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)、狹縫印跡技術(shù)和Northern印跡技在植物病毒檢測(cè)中的應(yīng)用方法進(jìn)行了全面的介紹，詳細(xì)描述了分析的過程和試驗(yàn)步驟，構(gòu)建了完善的檢測(cè)體系；Cohen等制作了一個(gè)針對(duì)柑橘樹上啤酒花矮化類病毒、柑橘裂皮類病毒、柑橘曲葉類病毒和柑橘類病毒Ⅲ號(hào)的復(fù)合探針，該探針能夠?qū)ι鲜霾《具M(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，具有較高的靈敏度和效率。核酸雜交技術(shù)還可以進(jìn)行植物病毒的鑒定，通過應(yīng)用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)待測(cè)樣品的病原物進(jìn)行雜交，可以對(duì)病毒進(jìn)行鑒定，如Hsu等就利用這一技術(shù)實(shí)現(xiàn)了馬鈴薯Y病毒組病毒的鑒定。

2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)能夠完成多數(shù)植物病毒的檢測(cè)和診斷，該檢測(cè)方法的步驟和原理是進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，使其轉(zhuǎn)錄成cDNA；通過1對(duì)特異性引物來進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)植物病毒進(jìn)行檢測(cè)；引物的設(shè)計(jì)是該方法的重點(diǎn)，可以根據(jù)病毒核酸基因組序列來進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。研究人員對(duì)RT-PCR技術(shù)在植物病毒檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了大量研究，Aparieio等通過應(yīng)用RT-PCR對(duì)油桃中的李壞死環(huán)斑病毒進(jìn)行了檢測(cè)，根據(jù)病毒的特異性和旋基因組序列設(shè)計(jì)了一堆特異性引物。通過RT-PCR擴(kuò)增得到特異性產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)了李壞死環(huán)斑病毒的檢測(cè)，同時(shí)該實(shí)驗(yàn)表明，花粉粒也能夠傳播病毒；Uga等采用RT-PCR完成了菜豆黃花葉病毒的檢測(cè)，該方法在獲得樣品的提取液之后，對(duì)粗汁液進(jìn)行稀釋，然后進(jìn)行電泳，最終得到了1條644bp的特異性條帶，完成了病毒檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在稀釋106倍之后，稀釋液中仍然可以檢測(cè)出病毒，說明該方法具有非常好的靈敏度；Grisoni等應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)香草中的馬鈴薯Y病毒進(jìn)行檢測(cè)，其對(duì)40個(gè)香草樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有36個(gè)樣品在327bp處出現(xiàn)了特異性條帶，即有36個(gè)香草樣品中攜帶了馬鈴薯Y病毒。當(dāng)前，RT-PCR技術(shù)還在不斷發(fā)展之中，研究人員對(duì)RT-PCR技術(shù)進(jìn)行了創(chuàng)新和改進(jìn)，出現(xiàn)了一些新的RT-PCR技術(shù)，包括嵌套式RT-PCR技術(shù)、免疫捕獲RT-PCR技術(shù)和多重RT-PCR技術(shù)等，這些技術(shù)在植物病毒檢測(cè)中都有重要應(yīng)用，現(xiàn)對(duì)這幾種技術(shù)的研究進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。在嵌套式RT-PCR技術(shù)研究方面，Morris等應(yīng)用這一技術(shù)實(shí)現(xiàn)了甜菜壞死黃脈病毒的檢測(cè)，相較于傳統(tǒng)的RT-PCR技術(shù)，這一技術(shù)的靈敏度高得多，可以達(dá)到傳統(tǒng)RT-PCR技術(shù)的1000倍；Foissac等應(yīng)用這一技術(shù)實(shí)現(xiàn)了果樹中蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖溝病毒等7種病毒的檢測(cè)，該實(shí)驗(yàn)表明，嵌套式RT-PCR技術(shù)在同時(shí)檢測(cè)多種病毒方面具有良好的效果。免疫捕獲RT-PCR技術(shù)研究方面，Cook等應(yīng)用這一技術(shù)實(shí)現(xiàn)了花生褪綠黑斑病毒的檢測(cè)，該方法的具體流程是應(yīng)用馬鈴薯Y病毒屬的單克隆抗體對(duì)PCR管進(jìn)行包被，并對(duì)樣品進(jìn)行處理；然后將處理好的樣品加入到PCR管內(nèi)，捕獲病毒作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，最終得到1條624bp的產(chǎn)物條帶，成功檢測(cè)了花生褪綠黑斑病毒。Teycheney等則綜合應(yīng)用了嵌套式RT-PCR技術(shù)和免疫捕獲RT-PCR技術(shù)，通過這2項(xiàng)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)香蕉輕型黃葉病毒進(jìn)行了成功檢測(cè)，該方法采用了抗BanMMV的多克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)管的包被，并進(jìn)行病毒的捕捉，然后以捕獲的病毒為模板進(jìn)行嵌套R(shí)T-PCR反應(yīng)，成功實(shí)現(xiàn)了病毒的檢測(cè)。在多種RT-PCR技術(shù)研究方面，Sanehez-Navarro等應(yīng)用這一技術(shù)實(shí)現(xiàn)了8種核果類果樹病毒的檢測(cè)，應(yīng)用該方法進(jìn)行病毒檢測(cè)，不僅具有較強(qiáng)的靈敏度，而且具有良好的特異性?？偟膩碚f，通過應(yīng)用改進(jìn)和創(chuàng)新了的RT-PCR技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的RT-PCR技術(shù)，在檢測(cè)效率、靈敏度等方面都有不錯(cuò)的提升。因此，對(duì)RT-PCR技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，對(duì)于提高植物病毒的檢測(cè)效率具有重要意義。

3 熒光定量PCR

熒光定量PCR技術(shù)是一種利用熒光實(shí)時(shí)信號(hào)，對(duì)整個(gè)PCR過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的PCR檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)能夠利用標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)未知模板的定量分析。熒光定量PCR技術(shù)是PCR檢測(cè)技術(shù)重要的進(jìn)步，該技術(shù)的出現(xiàn)使得PCR技術(shù)不僅僅是一項(xiàng)定性分析技術(shù)，而且可以進(jìn)行定量檢測(cè)。熒光定量PCR技術(shù)能夠在反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，條件簡(jiǎn)單，可以用于大規(guī)模樣品檢測(cè)，同時(shí)該技術(shù)具有良好的特異性，受污染問題的影響小，而且該檢測(cè)方法的自動(dòng)化程度較高，因此該方法在病毒檢測(cè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。隨著熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，在植物病毒檢測(cè)領(lǐng)域也獲得了重要應(yīng)用。如，Mukasa等利用熒光定量RT-PCR技術(shù)，對(duì)甘薯輕型斑駁病毒、甘薯褪綠矮化病毒和甘薯羽狀斑駁病毒在甘薯植物中復(fù)合侵染及相互作用進(jìn)行了鑒定；Bright等應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行馬鈴薯塊莖中的馬鈴薯A病毒、馬鈴薯X病毒和馬鈴薯Y病毒的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了這些病毒的定量檢測(cè)；Bertolini等應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了植物組織中柑橘速衰病毒的定量檢測(cè)。該方法相較于免疫捕獲RT-PCR技術(shù)，在靈敏度方面要高得多，可以達(dá)到免疫捕獲RT-PCR技術(shù)的1000倍，因此這一技術(shù)具有良好的應(yīng)用前景。鄭耘等應(yīng)用這一技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了煙草環(huán)斑病毒的檢測(cè)，該方法具有較高的靈敏度。

4 DNA微陣列技術(shù)

DNA微陣列技術(shù)是結(jié)合了眾多學(xué)科的核酸固相雜交技術(shù)，該技術(shù)中應(yīng)用了分子生物學(xué)、材料科學(xué)、信息科學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等知識(shí)，當(dāng)前這種技術(shù)在核酸序列測(cè)定、基因突變檢測(cè)、基因表達(dá)情況分析、微生物病原菌檢測(cè)、疾病診斷和藥物開發(fā)和篩選等方面都有重要應(yīng)用。在植物病毒領(lǐng)域，DNA微陣列技術(shù)也有著重要應(yīng)用。最早應(yīng)用DNA微陣列技術(shù)檢測(cè)植物病毒的是Lee團(tuán)隊(duì)，該團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用DNA微陣列技術(shù)對(duì)黃瓜綠斑駁病毒等引發(fā)葫蘆科植物病毒病的病毒進(jìn)行了檢測(cè)，具有良好的特異性和靈敏度。馬新穎等利用基因芯片技術(shù)，成功檢測(cè)了郁金香中的煙草脆裂病毒，在該實(shí)驗(yàn)中，TEV探針位置產(chǎn)生了較強(qiáng)的熒光信號(hào)，表明該郁金香種含有煙草脆裂病毒。

5 PCR-單鏈構(gòu)型多態(tài)性

PCR-單鏈構(gòu)型多態(tài)性(PCR-SSCP)是一種檢測(cè)突變技術(shù)，在不同地理區(qū)間下細(xì)菌、真菌以及病毒等的差異研究方面具有重要應(yīng)用，該技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速和成本低等方面的特點(diǎn)。該技術(shù)的原理是進(jìn)行靶DNA的PCR擴(kuò)增，然后對(duì)單鏈DNA的多態(tài)性進(jìn)行分析。在SS-CP凝膠中電泳時(shí)，單鏈DNA的二級(jí)空間結(jié)構(gòu)將直接決定其泳動(dòng)的速率，基于這一原理，如果DNA片段中有堿基出現(xiàn)了突變，則該DNA片段的二級(jí)空間結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化，這樣SS-CP的凝膠電泳結(jié)果會(huì)出現(xiàn)異常移動(dòng)的電泳帶；使DNA通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過對(duì)其電泳位置進(jìn)行分析，可以判斷出DNA片段上出現(xiàn)突變的堿基。這種方法也存在一定的缺陷，即其重現(xiàn)性比較差，因此檢測(cè)結(jié)果并不穩(wěn)定，同時(shí)也無法實(shí)現(xiàn)全部變異點(diǎn)位的檢測(cè)。相關(guān)學(xué)者對(duì)PCR-SSCP的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行了研究，如劉升學(xué)等利用這一方法對(duì)新疆甜菜壞死黃脈病毒進(jìn)行了檢測(cè)，研究顯示，來自新疆不同地區(qū)的病毒可以分析4個(gè)變異類型，即在新疆地區(qū)甜菜壞死黃脈病毒出現(xiàn)了分化，且這種分化具有明顯的地域分布性。

6 差異顯示PCR技術(shù)

差異顯示PCR技術(shù)最早被提出是在1992年，這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)單、靈敏度高，同時(shí)還能夠完成低豐度mRNA的分析，由于具有這些方面的優(yōu)點(diǎn)，使其在植物基因表達(dá)和克隆新基因等方面都獲得了重要應(yīng)用。當(dāng)前，差異顯示PCR技術(shù)已經(jīng)成為研究基因表達(dá)的重要手段，這一技術(shù)的原理是利用一系列的引物來實(shí)現(xiàn)真核生物中全部表達(dá)mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，然后利用PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)換成cDNA，利用凝膠電泳實(shí)現(xiàn)具有差異的DNA片段的分離，從而完成目的基因的篩選。當(dāng)前，差異顯示PCR技術(shù)在植物病毒檢測(cè)方面也有重要應(yīng)用，還可以通過其對(duì)抗病機(jī)理進(jìn)行研究。如，Benito等就應(yīng)用差異顯示PCR技術(shù)對(duì)番茄真菌病害的機(jī)理進(jìn)行了分析，研究結(jié)果表明，受到真菌侵染或者是遭到煙草枯斑病毒感染的番茄葉，與健康番茄葉相比，mRNA存在比較大的差異。植物被病菌入侵之后，植物防衛(wèi)基因會(huì)產(chǎn)生一系列的mRNA，然后產(chǎn)生蛋白來殺滅病菌；葉楠等應(yīng)用差異顯示PCR技術(shù)對(duì)大豆疫霉根腐病菌進(jìn)行了研究，選擇46種優(yōu)良大豆品種和大豆疫霉生理優(yōu)勢(shì)小種1號(hào)菌株進(jìn)行研究，研究其非親和互作中前后基因表達(dá)的差異，通過相關(guān)研究，從大豆基因中分離出9條與大豆疫霉根腐病抗病性相關(guān)的cDNA片段，同時(shí)對(duì)大豆疫霉根腐病菌的分子抗病機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，明確了抗病機(jī)制。

7 結(jié)語

植物病毒會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物發(fā)病，造成減產(chǎn)甚至絕收，給農(nóng)業(yè)帶來巨大損失。因此，加強(qiáng)植物病毒的防范非常重要，而對(duì)植物病毒進(jìn)行檢測(cè)是進(jìn)行植物病毒防治的基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其在植物病毒檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，核酸雜交技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR、DNA微陣列等分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)在植物病毒檢測(cè)中應(yīng)用越來越多，該技術(shù)具有檢測(cè)速度快、特異性好、靈敏度高和通量高等特點(diǎn)，對(duì)于提高植物病毒檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性具有重要意義，可以準(zhǔn)確、高效地完成植物病毒的檢測(cè)。