原兒茶醛對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)血管單元穩(wěn)態(tài)破壞的保護作用

馮晉 徐婭玲 孟慶婷 顏漢文 何芳雁

摘 要 目的：研究原兒茶醛對大鼠腦缺血再灌注損傷（CIRI）后神經(jīng)血管單元（NVU）穩(wěn)態(tài)破壞的保護作用。方法：將SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和原兒茶醛高、低劑量組（10、20 mg/kg），每組11只。給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積水，灌胃體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)5? d。末次給藥后，采用線栓法復(fù)制大鼠CIRI模型，采用透射電鏡觀察大鼠腦組織中NVU超微結(jié)構(gòu)的變化;采用Western blot法檢測大鼠腦組織中NVU相關(guān)蛋白[神經(jīng)元標(biāo)志蛋白（MAP-2）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、水通道蛋白（AQP-4）]的表達水平;采用免疫熒光染色法檢測大鼠大腦皮層中上述蛋白的陽性表達水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血腦屏障（BBB）結(jié)構(gòu)被嚴重破壞，血管腔變窄，內(nèi)皮細胞外側(cè)嚴重水腫，基底膜厚薄不一;神經(jīng)元核固縮，周圍組織存在大面積水腫;膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)嚴重破壞，胞體皺縮、細胞器損失;腦組織（或大腦皮層）中MAP-2蛋白表達水平（或陽性表達水平）均顯著降低（P<0.05或P<0.01），GFAP、AQP-4蛋白表達水平（或陽性表達水平）均顯著升高（P<0.01）。經(jīng)原兒茶醛干預(yù)后，大鼠BBB損傷減輕，血管腔和基底膜形態(tài)未完全被破壞;神經(jīng)元損傷減輕，神經(jīng)元核固縮減少，染色質(zhì)均勻、異染色質(zhì)減少;膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)破壞減輕，腦組織中GFAP、AQP-4（低劑量組除外）蛋白表達水平以及大腦皮層中MAP-2、GFAP蛋白陽性表達水平均顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：原兒茶醛可保護CIRI模型大鼠的NVU穩(wěn)態(tài)免受破壞;其作用機制可能與上調(diào)大鼠大腦皮層中MAP-2蛋白表達，下調(diào)腦組織中GFAP、AQP-4蛋白表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 原兒茶醛;腦缺血再灌注損傷;神經(jīng)血管單元;大腦皮層;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To observe the protective effect of protocatechuic aldehyde （PAL） on neurovascular unit （NVU） homeostasis damage in rats after cerebral ischemia-reperfusion injury （CIRI）. METHODS： SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， PAL high-dose and low-dose groups （10， 20 mg/kg）， with 11 rats in each group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically. Sham operation group and model group were given the same volume of normal saline intragastrically， 10 mL/kg once a day， for 5 days. After last administration， CIRI model was induced by suture method; the ultrastructural changes of NVU were observed by transmission electron microscope. Western blot assay was used to detect the expression of NUV related proteins （MAP-2， GFAP， AQP-4） in cerebral tissue. Immunofluorescence staining was used to observe the positive expression of above proteins in cerebral cortex. RESULTS： Compared with sham operation group， blood-brain barrier （BBB） structure of model group was destroyed severely， the vascular lumen became narrower， lateral edema of endothelial cells was severe， and the thickness of basement membrane varied; the nuclei of neurons were pyknosis and there was a large area of edema in the surrounding tissues; the structure of glial cells was seriously damaged， the cell body was shrunk and organelles were lost; protein expression （or positive expression） of MAP-2 in brain tissue （or cerebral cortex） were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）， while protein expression （or positive expression） of GFAP and AQP-4 were increased significantly （P<0.01）. After PAL intervention， the rats had less BBB damage， and the morphology of vascular lumen and basement membrane were not completely destroyed; the damage of neurons was alleviated， the pyknosis of neurons was decreased， the chromatin was homogeneous and the heterochromatin was decreased; the damage of glial cell structure was alleviated; protein expression of GFAP and AQP-4 （except for low-dose group） in cerebral tissue and positive expression of MAP-2 and GFAP protein in cerebral cortex were reversed significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： PAL can protect the stability of NVU from damage in CIRI model rats; the mechanism may be related to up-regulating the expression of MAP-2 protein in cerebral cortex and down-regulating the expression of GFAP and AQP-4 protein in brain tissue.

KEYWORDS? ?Protocatechuic aldehyde; Cerebral ischemia-reperfusion injury; Neurovascular unit; Cerebral cortex; Rats

《中國腦卒中防治報告（2018）》顯示，腦卒中居我國死亡原因之首[1]。其中，缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是腦卒中發(fā)病率最高的病種，其是由于腦血流的突然中斷導(dǎo)致腦細胞死亡和神經(jīng)缺陷的一類疾病[2]。在IS的病理發(fā)展過程中，血栓脫落、血栓自溶以及缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)的建立與開放等均會引起缺血區(qū)的血流重建，從而造成腦缺血再灌注損傷（CIRI），進而導(dǎo)致IS惡化[3]。IS的發(fā)生不僅影響神經(jīng)元，還影響位于“膠質(zhì)細胞-神經(jīng)細胞-血管小生態(tài)環(huán)境”中的所有腦細胞、細胞外基質(zhì)和機體免疫系統(tǒng)?；诖耍绹鴩疑窠?jīng)疾病和中風(fēng)學(xué)會提出了“腦神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）”的概念[4]，為臨床治療IS提供了新的策略——NVU穩(wěn)態(tài)的治療，強調(diào)從整體研究腦神經(jīng)血管系統(tǒng)的損傷及其機制，對IS的治療從單一環(huán)節(jié)擴展為對 NVU 各細胞成分的全面保護，以維持腦微環(huán)境的整體穩(wěn)定，促進神經(jīng)元存活和神經(jīng)功能的恢復(fù)，以期達到降低IS致殘率和病死率的目標(biāo)[5-7]。

NVU由神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞（Ast）、小膠質(zhì)細胞、血腦屏障（BBB）等成分組成[8-10];當(dāng)腦缺血再灌注后，部分神經(jīng)元變性壞死、Ast足突水腫、小膠質(zhì)細胞被大量激活，使得NVU的完整性被破壞，從而導(dǎo)致腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)失調(diào)[11-12]。

原兒茶醛為天麻的酚類成分（結(jié)構(gòu)式見圖1），具有保護BBB、抗血小板聚集和抗神經(jīng)炎癥等作用;且經(jīng)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，其對IS后的CIRI具有保護作用[13-14]。但是，原兒茶醛是否可通過作用于NVU發(fā)揮其保護CIRI的作用尚不明確?；诖?，本研究建立大鼠腦缺血再損傷模型，采用透射電鏡觀察NVU各組成成分（BBB、神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞）的結(jié)構(gòu)變化，采用Western blot法和免疫熒光染色法，研究原兒茶醛干預(yù)后對NVU相關(guān)蛋白[微管相關(guān)蛋白2（MAP-2）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、水通道蛋白（AQP-4）][15-17]表達水平的影響，以期為探討原兒茶醛對CIRI后NVU穩(wěn)態(tài)破壞的保護作用提供參考。

Fig 1 Chemical structure of PAL

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：Secura2250型分析天平（瑞士Precisa公司）、CF16RXⅡ型低溫高速離心機（日本Hitachi Koki公司）、UVP型顯色系統(tǒng)（美國Spectrum公司）、Cryo Star 型冰凍切片機（德國Leica公司）、JEM- 1400Flash型透射電鏡（日本電子株式會社）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：原兒茶醛（北京百靈威科技有限公司，批號P13N，純度98%），TTC試劑（上?；菔郎噭┯邢薰荆?20808），多聚甲醛（天津化學(xué)試劑研究所，批號20100525），水合氯醛（廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號20100926），兔抗MAP-2多克隆抗體（美國Abcam公司，批號GR288637-1），鼠抗AQP-4多克隆抗體、兔抗GFAP多克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的免疫球蛋白G（IgG）二抗、化學(xué)發(fā)光顯影劑（美國Proteintech公司，批號分別為C520BA0013、00023078、10004157、20000003、B2202003），二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號090119191205）;其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量240～270 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（川）2020-020。大鼠每天定時供應(yīng)食水，并定期更換墊料，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～24 ℃、相對濕度為40%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進行后續(xù)實驗。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將48只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和原兒茶醛低、高劑量組（10、20 mg/kg，劑量根據(jù)前期研究結(jié)果和參考文獻[13]設(shè)置），每組11只。給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物（臨用時以水進行溶解），假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積水，灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)5 d。末次給藥后，對大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）進行麻醉，并以仰臥位固定于37 ℃恒溫加熱鼠板上;參考文獻[18-20]中的線栓法，取大鼠頸正中偏右切口，暴露右側(cè)頸總動脈（CCA）和迷走神經(jīng)并進行鈍性分離。將CCA遠心端打一活結(jié)，近心端結(jié)扎，并在結(jié)扎上部剪一“V”型小口，將栓線沿“V”型小口插入，直至尼龍線前端到達大鼠大腦中動脈（MCA）起始處（線栓插入長度大約為18～20 mm）;栓塞2 h后，緩慢輕拉尼龍栓線，以復(fù)制CIRI模型大鼠。假手術(shù)組大鼠同法分離血管后，不插入拴線。造模后，參考文獻[21-22]方法，對大鼠進行神經(jīng)學(xué)評分：0分為無神經(jīng)功能缺損癥狀，1分為輕度局灶性神經(jīng)功能缺損（即提尾懸空不能伸展左側(cè)前爪），2分為中度局灶性神經(jīng)功能缺損（即行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈），3分為中度局灶性神經(jīng)功能缺損（即行走困難，并向左側(cè)傾倒），4分為重度局灶性神經(jīng)功能缺損（即不能自發(fā)行走、意識水平下降）;并以激光多普勒檢測大鼠腦血流量。當(dāng)大鼠神經(jīng)學(xué)評分為1～3分且腦血流量降至其基礎(chǔ)值的20%左右，并在再灌注2 h后腦血流量恢復(fù)至其基礎(chǔ)值的50%以上，則表明造模成功。

2.2 大鼠腦組織中NVU超微結(jié)構(gòu)的觀察

造模成功后，各組取2只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，并以生理鹽水和4%多聚甲醛進行心臟灌流;灌流后，斷頭取大鼠額頂區(qū)腦組織，將其切成5片厚度為1 mm的切片，以雙醛固定液浸泡3次，每次10 min;以2.5%戊二醛和2%四氧化鋨固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋;再以醋酸鈾、枸椽酸鉛雙重染色，然后采用透射電鏡觀察大鼠腦組織中NVU超微結(jié)構(gòu)的變化。

2.3 大鼠腦組織中NVU相關(guān)蛋白表達的檢測

采用Western blot法進行檢測。各組取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，以生理鹽水進行心臟灌流后，迅速取出腦組織，置于冰上分離出缺血側(cè)（右側(cè)）大腦皮層和海馬組織，加入蛋白裂解液提取蛋白;以14 000 r/min離心10 min，分離上層蛋白液，采用BCA法檢測蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉1.5 h;以TBST緩沖液清洗5 min×3次，加入MAP-2、GFAP、AQP-4、β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃條件下孵育過夜;以TBST緩沖液清洗5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），室溫下孵育2 h;以TBST緩沖液清洗5 min×3次，加入化學(xué)發(fā)光顯影劑，采用顯色系統(tǒng)成像。采用Image J v1.8.0軟件進行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.4 大鼠大腦皮層中NVU相關(guān)蛋白陽性表達的檢測

采用免疫熒光染色法進行檢測。取對照組、模型組和原兒茶醛高劑量組大鼠各3只（因本課題組實驗經(jīng)費有限，故僅選擇了原兒茶醛高劑量組大鼠進行免疫熒光染色實驗），以生理鹽水和4%多聚甲醛進行心臟灌流后，斷頭取大鼠腦組織，將腦組織于20%蔗糖溶液和30%蔗糖溶液中脫水過夜;取出腦組織，進行包埋、冰凍切片。切片晾干后，以0.01 mol/L PBST緩沖液沖洗3次×5 min，然后滴加MAP-2、GFAP、AQP-4一抗（稀釋度分別為1 ∶ 100、1 ∶ 50、1 ∶ 500），于4 ℃條件下孵育過夜;以0.01 mol/L PBST緩沖液沖洗5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），室溫下孵育40 min;以0.01 mol/L PBST緩沖液沖洗5 min×3次，封片。采用顯微鏡觀察切片中大鼠缺血側(cè)（右側(cè)）大腦皮層中MAP-2、GFAP和AQP-4的陽性表達情況。采用Image J v1.8.0軟件計算各目的蛋白陽性染色面積百分比，其值越大，則表示目的蛋白陽性表達水平越高。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，則以x±s表示，多組間比較時采用單因素方差分析，組間兩兩比較時采用LSD檢驗;若不符合正態(tài)分布則以中位數(shù)表示，采用非參數(shù)檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 原兒茶醛對大鼠腦組織中NVU超微結(jié)構(gòu)的影響

假手術(shù)組大鼠BBB結(jié)構(gòu)完整，血管內(nèi)皮細胞正常，基底膜厚薄均一;神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常、無明顯變化，染色質(zhì)分布均勻;膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)完好，細胞核、細胞器完整，周圍組織無水腫。模型組大鼠BBB結(jié)構(gòu)被嚴重破壞，血管腔變窄，內(nèi)皮細胞外側(cè)嚴重水腫，基底膜厚薄不一;神經(jīng)元核固縮，周圍組織存在大面積嚴重水腫;膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)嚴重破壞，胞體皺縮、細胞器損失。原兒茶醛各劑量組大鼠與模型組比較，其BBB損傷減輕，血管腔和基底膜形態(tài)未完全被破壞;神經(jīng)元損傷減輕，神經(jīng)元核固縮減少，染色質(zhì)均勻、異染色質(zhì)減少;膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)破壞減輕，詳見圖2。

3.2 原兒茶醛對CIRI模型大鼠腦組織中NVU相關(guān)蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中MAP-2蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），GFAP、AQP-4蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，原兒茶醛各劑量組大鼠腦組織中MAP-2蛋白表達水平有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而GFAP、AQP-4（原兒茶醛低劑量組除外）蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），詳見表1、圖3。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05

Note：vs. sham operation group，*P<0.05，**P<0.01; vs. model group，#P<0.05

3.3 原兒茶醛對CIRI模型大鼠大腦皮層中NVU相關(guān)蛋白陽性表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠大腦皮層中MAP-2蛋白的陽性表達水平顯著降低（P<0.01），GFAP、AQP-4蛋白的陽性表達水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，原兒茶醛高劑量組大鼠大腦皮層中MAP-2蛋白的陽性表達水平顯著升高（P<0.01），GFAP蛋白的陽性表達水平顯著降低（P<0.01），AQP-4蛋白的陽性表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），詳見表2、圖4。

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01;與模型組比較，##P<0.01

Note：vs. sham operation group，**P<0.01; vs. model group，##P<0.01

4 討論

CIRI是一個復(fù)雜的病理生理過程，涉及能量代謝障礙、興奮性氨基酸過度釋放、炎癥反應(yīng)、自由基堆積、細胞凋亡等多個病理環(huán)節(jié)[23]。NVU是由BBB、神經(jīng)元、Ast、小膠質(zhì)細胞等支持細胞組成的功能性結(jié)構(gòu)，各細胞之間相互協(xié)調(diào)、共同維持腦組織內(nèi)環(huán)境的整體穩(wěn)態(tài);其對腦缺血早期的炎癥反應(yīng)以及后期的血管新生進程具有重要的作用[11-12]。當(dāng)發(fā)生局灶性腦缺血時，NVU中BBB、神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞均受到不同程度的損害，從而使得NVU的完整性被破壞[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠CIRI后其BBB結(jié)構(gòu)被嚴重破壞;神經(jīng)元核固縮，周圍組織存在大面積嚴重水腫;膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)嚴重破壞。經(jīng)原兒茶醛干預(yù)后，大鼠BBB、神經(jīng)元損傷減輕，膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)破壞減輕。這表明原兒茶醛能保護大鼠CIRI后NVU超微結(jié)構(gòu)的完整性。

MAP-2是神經(jīng)元細胞骨架的重要組成部分，其表達水平能反映神經(jīng)元樹突的破壞情況[6];GFAP是Ast的骨架蛋白，其表達水平能反映Ast的活化情況[25]; AQP-4是腦內(nèi)主要的水通道蛋白，在BBB和腦-腦脊液屏障的Ast中高度表達，其表達水平可反映腦內(nèi)水平衡和組成BBB完整性結(jié)構(gòu)的緊密連接蛋白的損傷情況[26]。本研究的Western blot法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)低、高劑量原兒茶醛干預(yù)后，CIRI模型大鼠腦組織中GFAP、AQP-4（低劑量組除外）蛋白表達水平均顯著降低，而MAP-2蛋白表達水平的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;免疫熒光染色法結(jié)果顯示，經(jīng)高劑量原兒茶醛干預(yù)后，CIRI模型大鼠大腦皮層中MAP-2蛋白的陽性表達水平顯著升高，GFAP的陽性表達水平顯著降低，而AQP-4蛋白的陽性表達水平的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這提示原兒茶醛對MAP-2、GFAP蛋白的影響主要在大鼠大腦皮層區(qū)，對AQP-4蛋白的影響可能不在大腦皮層區(qū)。

綜上所述，原兒茶醛可保護CIRI模型大鼠的NVU穩(wěn)態(tài)免受破壞;其作用機制可能與上調(diào)大鼠大腦皮層中MAP-2蛋白表達，下調(diào)腦組織中GFAP、AQP-4蛋白表達有關(guān)。

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（收稿日期：2021-02-18 修回日期：2021-05-06）

（編輯：唐曉蓮）